生化3第三章核酸化学课件

第三章核酸化学NucleicAcidchemistry1.核酸的化学组成结构及其性质2.核酸的测定方法3.核酸的研究技术4.了解人类基因组计划重点：1.RNA.DNA一级结构的测定原理与方法2.双螺旋结构要点，三叶草结构要点3.核酸研究的常用技术及应用4.核酸含量的测定原理与方法难点：1.DNA一级结构测定的原理与方法2.核苷酸的两性离解3.双螺旋结构的要点教学目的1868年，F.Miescher从细胞核中分离得到一种酸性物质，即现在被称为核酸的物质。and可分离mRNA(5%)真核tRNA(10-15%)rRNA（80%）SnRNA(核内）sRNASnoRNA(核仁）RNAmRNAScRNA(胞内)原核tRNArRNA病毒：RNA病毒核酸的功能1、DNA是遗传信息的载体2、RNA的功能参与遗传与进化参与蛋白质的生物合成参与RNA转录后的加工修饰参与基因表达调节催化等第一节核酸的组成成分一.元素组成CHONP(9%-9.9%)核酸核苷酸核苷磷酸碱基戊糖嘌呤嘧啶核糖脱氧核糖核酸酶核苷酸酶核苷酶鸟嘌呤腺嘌呤尿嘧啶胞嘧啶胸腺嘧啶RNA:P-9%,DNA:P-9.9%核酸的组成单位：核苷酸核酸的组成成分：碱基，戊糖，磷酸二.组成成分及组成单位（二）、碱基1.嘌呤（Purine）碱123456978腺嘌AdenineA鸟嘌呤guanineG嘌呤（Purine）2.嘧啶（Pyrimidine）碱嘧啶（Pyrimidine）123456尿嘧啶uracilU胞嘧啶CytidineCTH3C胸腺嘧啶Thy(三)、核苷（nucleoside）核苷戊糖+碱基糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键1’2’3’4’5’(OH)1’2’3’4’5’(OH)5OH假尿苷（ψ）次黄苷（肌苷）I黄嘌呤核苷X二氢尿嘧啶核苷D取代核苷的表示方式7-甲基鸟苷m7G（四）、核苷酸（nucleotide）H（五）.核苷酸衍生物1.继续磷酸化AMPADPATP3.环化磷酸化

cAMP

cGMP4.肌苷酸及鸟苷酸(强力味精)IMPGMP第二节、RNA的分子结构一、RNA的一级结构（一）连接方式5’5’3’3’5′PdAPdCPdGPdTOH3′5′PAPCPGPUOH′或5′ACGTGCGT3′5′ACGUAUGU3′

ACGTGCGTACGUAUGUT5’3’OHU5’3’OH5′-磷酸端（常用5’-P表示）；3′-羟基端（常用3’-OH表示）多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是5′→3′或是3′→5′。多聚核苷酸的表示方式DNARNA二、RNA的降解1、RNA的化学降解碱降解：RNA用稀碱降解产物为2’-核苷酸和3’-核苷酸混合物。DNA抗碱(高温不抗碱)酸降解：水解速度嘌呤糖苷键>嘧啶糖苷键脱氧核糖糖苷键>核糖糖苷键糖苷键>脂键在低温的酸性条件下DNA，RNA则稳定2.酶法降解核酸酶有:外切酶，内切酶和磷酸酯酶牛胰RNaseI产物：3’-嘧啶核苷酸（结尾）内切酶RnaseT1产物：3’-鸟嘌呤核苷酸（结尾）RnaseU2产物：3’-嘌呤核苷酸（结尾）SPDase(牛脾)5’-端开始，产物：3’-核苷酸外切酶VPDase(蛇毒)3’-端开始，产物：5’-核苷酸磷酸单酯酶（PNase）5’-磷酸（二）酶的部分降解及产物的分离1、尿素柱层析2、双向电泳3、凝胶电泳（一）RNA的二级结构四.RNA的高级结构占RNA总量的15％一种氨基酸对应最少一种RNA分子量25000左右，大约由70－90个核苷酸组成，沉降系数为4S左右。分子中含有较多的修饰成分。3'-末端都具有CpCpAOH的结构。1.特点2.三叶草结构要点（二）tRNA的三级结构第三节DNA的分子结构一、DNA的一级结构及测定1.加减法2.双脱氧法3.化学修饰法二.DNA的二级结构2.0nm小沟大沟

双螺旋DNA的结构参数类型旋转方向结晶状态螺旋直径（nm）螺距（nm）每转碱基对数目碱基对间垂直距离（nm）碱基旋转角度A－DNAB－DNAC-DNAz－DNA右75%Na+右92%Na+右66%Li+左人工合成2.02.31.921.82.83.43.14.511109.3120.2550.340.330.2732.7º36º38º-60ºH-DNA三、DNA的三级结构DNA双螺旋的进一步扭曲构成三级结构，负超螺旋

原核双链环状DNA（dcDNA）病毒单链环状DNA（scDNA）单链线性DNA（ssDNA）第四节核酸及核苷酸的性质一、溶解性DNA在PH4.2时溶解度最低。RNA在PH2-2.5时溶解度最低。1.水溶性微溶于水，不溶于有机溶剂,水中溶解度DNA达2%，RNA达4%2.盐溶性DNA-蛋白，溶于1mol/LNacl，低盐不溶。RNA-蛋白，溶于0.14mol/LNacl，高盐不溶。3.不同PH的溶解性二.两性性质1.腺嘌呤2.鸟嘌呤:4.尿嘧啶胸腺嘧啶3.胞嘧啶核苷酸两性离解及等电点三、核酸的紫外吸收特性在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。以A260/A280进行定性、定量DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭（EB），在紫外下发出荧光四、核酸的变性与复性（一）.变性变性:稳定核酸双螺旋次级键断裂，空间结构破坏，变成单链结构的过程。核酸的的一级结构(碱基顺序)保持不变。变性表征:生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应）变性因素:

pH（>11.3或<5.0）变性剂（脲、甲酰胺、甲醛），低离子强度加热热变性和Tm:DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度称熔解温度，用Tm表示。一般DNA的Tm值在70-85C之间。DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关。G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G,C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)*2.44（二）.核酸的复性变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性。DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复，具有减色效应。将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变性的DNA缓慢冷却时可复性，因此又称为“退火”。退火温度＝Tm－25℃复性影响因素片段浓度/片段大小/片段复杂性（重复序列数目）/纯度/溶液离子强度第五节核酸及其组分的分离纯化与测定一.分离纯化的一般原则1.防止核酸酶降解2.防止化学因素降解3.防止物理因素降解二.DNA的分离纯化三.RNA的分离纯化四.核酸组分的分离纯化

破细胞（1mol/LNACL）

离心去沉淀（含RNA-Pr）上清（含DNA-Pr）SDS法/酚法（去蛋白）离心去沉淀（变性蛋白）上清（含DNA）乙醇沉淀离心收集沉淀（DNA）

细胞（饱和酚处理）离心去沉淀（含DNA-Pr）上清液调节PI（RNAPI）离心去上清收集沉淀（总RNA）不同的RNA分离时可用：DEAE-Sephadex超离心Olig-dt亲和层析1.离子交换法：四种核苷酸之间的分离采用离子交换法阳离子交换剂洗脱次序：理论次序

UGAC实际次序UGCA阴离子交换剂洗脱次序：理论次序CAGU实际次序CAUG2.凝胶过滤法:碱基,核苷,核苷酸之间的分离采用Sephadex-G10/G25洗脱次序：核苷酸核苷碱基核苷一磷酸,核苷二磷酸,核苷三磷酸的分离采用柱层析和薄层层析法分离.柱层析洗脱次序AMPADPATP薄层层析迁移次序AMPADPATP3.DEAE-纤维素法:

五.核酸及其组分含量的测定与纯度测定（一）.核酸含量的测定方法1.紫外吸收法1ug/mlDNAA260=0.021A260=50Ug/mlDNA1ug/mlRNAA260=0.022-0.0241A260=40Ug/mlRNA2.定糖法(20-250ugRNA,40-400ugDNA)苔黑酚法：苔黑酚+核糖+浓HCl+FeCl3绿色A670-680二苯胺法：二苯胺+脱氧核糖+浓H2SO4蓝色A595-6203.定磷法(10-100ug核酸)4.凝胶电泳EB(0.5ug/ml)染色,最小检出量1ngVitCH3PO4+钼酸铵黄色磷钼酸铵磷钼蓝A650-660（二）.核酸纯度的测定1.紫外吸收法测定A260与A280A260A280=1.8-2.0DNA:2.凝胶电泳3.等密度梯度≥2.0RNA:A260A280第六节核酸研究的常用技术一.DNA的凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶电泳1.琼脂糖凝胶浓度及选择2.琼脂糖凝胶电泳的分辨率3.琼脂糖凝胶电泳的用途(分离,测量,回收,印迹)（二）PAGE电泳1.PAGE浓度及选择2.PAGE电泳的分辨率3.PAGE电泳的用途（三）影响凝胶电泳Rf值的因素1.分子大小2.分子构象3.凝胶浓度4.电流电压5.温度二.印迹技术与分子杂交（一）.印迹技术概念:核酸的杂交中，经过凝胶电泳分离的DNA/RNA分子，杂交之前通过毛细管吸附作用/电导作用将凝胶中DNA/RNA分子原封不动地转移到滤膜上。滤膜:硝酸纤维素滤膜，DEAE-纤维素滤膜印迹种类:Southernblotting:（1975）Northernblotting:（1979，Alwine)（1979，Towbin,Immunoblotting-Western;1982,Reihart,Eastern)电转移技术:(1983,Aubertin)（二）.核酸杂交核酸杂交的概念:DNA单链与在某些区域有互补序列的异源DNA单链或RNA链形成双螺旋结构的过程。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。核酸杂交方法：Southernblotting杂交技术:Northernblotting杂交技术:点杂交技术:菌落/噬菌体的原位杂交技术:（三）.杂交检测方法—放射自显影点杂交三.PCR技术-DNAPolymeraseChainReaction（一）基本步骤引物1pmol/ul,dNTP200umol/l,Taq酶2u/100ul94̊c5-10min褪火45s-60s保温72̊c1min（二）PCR技术的应用1.遗传病，疑难病的诊断及产前检查2.病原体的检测3.癌基因的检查4.基因组测序5.基因探针的制备6.基因突变的分析及定位诱变7.cDNA库的构建,DNA重组,基因分离与克隆8.法医及刑事鉴定（三）PCR技术的特点1.引物設计:(引物的长度一般为18～25bp)扩増长度一般在200～800bp之间2.扩増效率:2n,DNA量增加106～109倍3.扩増温度:G＋C含量和Tm值,一般在40－60%之间，两条相差2－3℃,72℃.4.末端核苷酸:3’端不得