动物实验graduate2013课件

第八章医学研究中实验设计动物的选择及应用

动物实验与动物实验技术2010.01“I’msoproud!Allofmykidsaregoingintoresearch”田枫实验动物科学部主要内容动物实验中实验动物的选择人类疾病动物模型影响动物实验的因素动物实验基本技术如何做好动物实验动物实验是根据研究目的，恰当地选用标准的实验动物品种、品系，进行各种科学实验，观察和记录动物的反应过程或反应结果，以探讨或检验生命科学中未知因素的一种活动。是生物研究中的重要方法之一，也是从动物身上获得有关情报资料的唯一手段。

关于动物实验动物实验与诺贝尔生理或医学奖（续）动物实验中实验动物选择相似性原则特殊性原则标准化原则规格化原则经济性原则原则相似性原则

利用与人体某些机能、代谢、结构及疾病特点的相似性选择实验动物组织结构：猪的皮肤组织结构与人类的相似系统机能：犬有发达的血液循环和神经系统，毒理方面反应和人也较接近繁殖特性：哺乳动物和人近似，性成熟、妊娠期和寿命一般是成比例的疾病特点：如旱獭肝炎病毒感染体液成分：鸟类粪尿混合排出；草食动物尿液呈碱性；肉食动物尿液呈酸性。选择时要注意解剖特性：有些动物的解剖结构与人类差别较大，要特别注意供研究用近交系小鼠

实

验

研

究

类

别

动

物

品

系心血管疾病DBA／2N自身免疫性疾病NZB／N、

脑积水 C57BL／KaLwN、D2／nSnN肾盂积水C57L／N、STR／N白内障STAR／N牙周病DBA／2N(有抗力)、STR／N(易感)多尿症STR／N、STR／1N白血病L615、L7212腭

裂A／HeN(自发)、C57BL／6N(诱发)放射线有抗力：C57BL／6N

敏感：BALB／cAnN，LACA．淀粉样变A／HeN，NZW／N补体BALB／cAnN(活性高)．DBA／2N(活性低)人和实验动物在解剖、生理及代谢方面的比较

动物

相似点

相异点小鼠大鼠

兔

猫

狗

猪

老龄肝变化脾脏，老龄胰变化，老龄脾变化

脾脏血管，脾脏，免疫，神经分布脾脏血管，蝶骨窦，表皮，锁骨，硬膜外，脂肪分布，鼓膜张肌垂体血管，肾动脉，脾脏，脾脏血管，蝶骨窦，肾表血管，肝脏，表皮核酸代谢，肾上腺神经分布，精神变化心血管分支，红细胞成熟，视网膜血管，胃肠道，肝脏，牙齿，肾上腺，皮肤，雄性尿道

肝脏，脾脏（雄比雌大50%），无汗腺网膜循环，肝脏循环、无胆囊、汗腺

肝脏，汗腺，细支气管，肺

脾脏，对异种蛋白的反应，汗腺，喉部中隔，性索的发育，睡眠，热调节肠道循环，网膜循环，肾动脉，胰管，热调节，汗腺，膈，喉神经，睡眠脾脏，肝脏，汗腺，丙种球蛋白(新生)

标准化原则选择与研究内容相匹配的标准化实验动物，以保证实验的准确性与可重复性。标准化动物系指经遗传学、微生物学、环境及营养控制而繁育的动物。经济性原则无菌兔人类疾病动物模型WhatistheAnimalModel?ananimalmodelinwhichnormativebiologyorbehaviorcanbestudied,orinwhichaspontaneousorinducedpathologicalprocesscanbeinvestigated,andinwhichthephenomenoninoneormorerespectsresemblesthesamephenomenoninhumansorotherspeciesofanimal.医学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物实验对象和相关材料。Spontaneous(genetic)DiseaseModels

Thesemodelsofhumandiseaseusenaturallyoccurringgeneticvariants(mutants).Manyhundredsofstrainsandstockswithinheriteddisordersmodelingsimilarconditionsinhumanshavebeencharacterizedandconserved.指实验动物未经任何人工处置，在自然条件下动物自然发生、或由于基因突变的异常表现通过遗传育种保留下来的动物模型。SpontaneouslyHypertensiveRatsCoatColor:AlbinoFeatures:usedforstudiesinhypertensionandcardiovascularresearch.Males,twelveweeksofageorolder,dependablyexhibitaveragesystolicbloodpressuresgreaterthan200mmHg.Progenyaremonitoredforelevatedbloodpressuretoinsurecontinuedphenotypicexpressionofhypertension.DetailsofSpontaneousDiseaseModels血压测定Non-ObeseDiabetic(NOD)MiceCoatColor:AlbinoFeatures:TheNODexhibitsdestructiveautoimmunepancreaticinsulitisasearlyasfourweeksofage.Insulin-dependentdiabetesisseeninfemalesbythreemonthsofage.SenescenceAcceleratedMouse

EstablishedintheDepartmentofSenescenceBiology,KyotoUniversity,Japanasanovelmurinemodelofsenescenceaccelerationandage-associateddisorders.Thisstrainincludesninestrainsofacceleratedsenescence-prone,shortlivedmice

(SAMP)andthreestrainsofacceleratedsenescence-resistant,longlivedmice(SAMR).

SenescenceAcceleratedMouse

EachSAMPstrainshowsrelativelystrainspecificage-associatedpathologies.Thesecharacteristicpathologicalphenotypesaresimilartoage-associateddisordersoftenobservedinelderhumans.Theyincludesenileosteoporosis,osteoarthrosis,age-relateddeficitsinlearningandmemorywith/withoutforebrainatrophy,presbycusis,senileamyloidosis,age-relatedimpairmentoftheimmuneresponseandsoon.

SAMP8SAMR1MorisAssessmentofSpontaneousModelAdvantagesSpontaneouslydeveloping（自然发生）Similartohumandiseases（与人类疾病有较好的相似性）DisadvantageLimitedquantityanddifficulttoapply（数量有限，应用有难度）Induced（Experimental)DiseaseModelsAsthenameimplies,inducedmodelsarehealthyanimalsinwhichtheconditiontobeinvestigatedisexperimentallyinduced.以物理的、化学的或生物的致病因素作用于动物，造成动物组织、器官或全身一定的损害，出现某些类似人类疾病时的功能、代谢或形态结构方面的改变，以供研究用。DiabetesModel

注射致高血糖因子，如生长激素、胰高糖素、糖皮质激素以及儿茶酚胺类激素等。注射化学物质引起胰岛β细胞的损伤，如链脲佐菌素(STZ)、四氧嘧啶可造成胰岛β细胞不可逆损伤；环丙庚哌、天门冬素酶等可引起β细胞可逆性损伤。注射生物及生物制品引起β细胞破坏，如鼠脑炎、心肌炎病毒M型变异可诱发若干品系的成年小鼠糖尿病。手术切除胰腺的大部分或全部，并给予高糖饮食刺激，引起继发性永久性糖尿病。AssessmentofInducedModelQuantityenough（数量足够）Conditionaccord（条件一致）和自然产生的疾病模型在某些方面存在一定差异。动物模型复制原则相似性可重复性可靠性适用性和可控性易行性和经济性ImmunodeficiencyAnimalModelAnimalsiscertainorsomeimmunodeficiencybecauseofspontaneousorartificialmethods.由于先天遗传突变或用人工方法造成免疫系统某种或多种成分缺陷的动物。ClassificationofImmunodeficiencyAnimal

CongenitalImmunodeficiencyanimal（先天性）

T-lymphocytedeficiencyanimal：nudemice,nuderatsB-lymphocytedeficiencyanimal：CBA/NmiceNKcelldeficiencyanimal：Beigemice

Severecombinedimmunedeficiency：SCIDmiceAcquiredimmunodeficiencysyndrom（获得性）

primate,miceandcatAIDSmodelT-lymphocyteDeficiencyAnimalHistoryofNudeMice1962年英国格拉斯哥医院Grist在非近交系的小鼠中偶然发现有个别小鼠无毛。1966年证实是由于第11对染色体基因突变所致。1968年，Pantelouris解剖发现裸鼠失去了正常的胸腺。1969年Rygaard首先将人结肠腺癌移植裸小鼠获得成功。

由于裸鼠原种抵抗力差，生育力低，寿命短，不能用于实际。和纯系BALB/C，C3H，C57BL/6小鼠交配，不断选育，获得了三种近交系鼠（InbredNudeMice）新种。裸鼠自发现以来，广泛应用于肿瘤学、免疫学和病毒学等多个学科的研究。AnatomyandPhysiologyFeature胸腺残留一些上皮样细胞；淋巴组织胸腺依赖区的淋巴细胞消失；外周血淋巴细胞减少。虽然有原始的T细胞，但缺乏成熟的T细胞。T细胞的辅助，抑制及杀伤功能不全。无接触敏感性，无移植排斥，无移植物抗宿主反应。B细胞数量正常但功能有缺陷，合成的免疫球蛋白主要是IgM，只有少量IgG。

粒细胞功能较低，NK细胞活性高。裸大鼠NudeRats毛色特征：（1）白色，黑色，黑白相间；（2）部分个体在发育的不同阶段，会出现有毛和无毛现象的交替。品系来源：

1979-1980年期间，含有裸基因的8个近交系大鼠在一系列交配之后育成了NIH裸大鼠。2001年CharlesRiver从NIH引入，进行剖腹产净化，命名为Crl:NIH-Foxn1rnu。2008年11月维通利华从CharlesRiver引入该品系核心群。裸大鼠NudeRats繁育信息：（1）1：1比例交配（♂rnu/rnu×♀rnu/+）（2）妊娠期21-23天，离乳期21天；（3）产仔数：10-12只/窝品系特征：

该品系没有胸腺，缺乏T细胞，在胸腺外周淋巴器官的主要区域表现为细胞群体衰竭特征。主要用途：

肿瘤生物学和肿瘤移植研究：皮肤肿瘤与皮肤癌、中枢神经系统肿瘤；外伤与整形外科面的研究。注意裸鼠并不是真正意义上的无毛，长毛是一种正常的生理现象。裸鼠出生后大约十天左右，在头面部、颈部可见稀疏的毛发生长；随着周龄增加，在躯干的其他部位也可见稀疏毛发的生长。这些穿透了表皮的毛杆也是严重扭曲的，而且经常在长到应有长度前就折断了。

KMHairlessMiceA:Heterozygousmiceat10months.B,C:Homozygousmiceat10months.Themutantmouseiscoveredwithsparsehair,andcannotopenitseyesnormallyScd1ab-XymutationB-lymphocyteDeficiencyAnimalCBA/N

BcellfunctionislowSevereCombined

ImmuneDeficiencyAnimalSCIDmiceCB-17小鼠中由于第16对染色体隐性基因突变，纯合突变导致淋巴细胞抗原受体基因VDJ区域重排的重组酶活性异常，基因重排时断裂无法正常连接，从而影响B、T细胞的正常功能分化。外观体重与普通小鼠相同。对鼠肝炎，巴氏杆菌、卡氏肺囊虫极易感染，感染后易发病死亡。SPF环境没有B、T阳性标志细胞，对外来抗原无细胞和体液免疫NK、LAK细胞功能正常或增高；FeatureofSCIDTheC.B-17-sciddoesexhibitextremelylowlevelsofIgin~20%ofthemiceat12weeksofage.TheincidenceofIgwillincreaseasthemiceage.Despitethis“leakiness”（渗漏）C.B-17-scid'sdonotmountanantibodyresponsetochallengebyimmunogenicmaterial.

(部分小鼠出现低水平的功能性T和B细胞,血清中Ig含量明显升高)。

C3HSCID小鼠scid突变基因引入C3H小鼠中而育成C3HSCID重组近交系。C3HSCID小鼠与CB-17SCID小鼠的不同除背景基因不同外，发现在三月龄时C3HSCID小鼠仅有15%可测到血清免疫球蛋白，而CB-17SCID小鼠则达79%。C3HSCID小鼠并不因年龄的增长而增加血清免疫球蛋白阳性的比例，也不会随年龄增加血清中免疫球蛋白浓度。SCID.BG小鼠利用BALB/c-beige/beige同源近交系（congenicstrain）小鼠将beige基因引入CB-17SCID小鼠。beige基因突变小鼠降低体内NK细胞（Naturalkillercells）活性。NOD/Lt-SCID小鼠用非肥胖糖尿病小鼠NOD/Lt与SCID小鼠杂交，降低了Nk细胞活性。SHO（SCIDHairlessOutbred）人们一直想让SCID小鼠拥有裸鼠无毛的优点CharlesRiverLab的研究人员自2007年开始就着手培育无毛的SCID小鼠，他们通过Crl:HA-Prkdcscid和Crl:SKH1-Hrhr这两个品系杂交，最终在2008年得到了两条染色体上均带有SCID基因的无毛封闭群小鼠模型SHO（SCIDHairlessOutbred）.2008年6月，实验人员通过对比的方法将人前列腺癌细胞株PC-3分别接种到SCID和SHO身上，研究发现，SHO除去具有与SCID小鼠相同的肿瘤生长特性之外，还摒除了Nu/Nu裸鼠接种PC-3时出现的皮肤溃疡现象。免疫系统人源化小鼠将人的胚胎胸腺造血干细胞等移植到免疫缺陷小鼠，可有效地建立人类天然与适应性免疫系统。免疫系统相关疾病研究及免疫药物研发提供了良好实验模型。未来人源化小鼠模型的发展趋势是为免疫缺陷小鼠敲入多种人的基因，使小鼠体内表达人的细胞因子或其他受体，从而获得更好的人来源的细胞重建。Other

ImmuneDeficiencyAnimalNZBWF1

野生色WBB6F1—W/WV

（WB—W/+♀XC5TBL/6—WV/+）F1Anaemia,gastriculcer，bonemarrowfailuremodelWhite,blackeye疾病动物模型的注意事项没有一种动物模型能完全复制人类疾病，模型实验结论的正确性只是相对的，最终必须在人体身上得到验证。尽可能使模型动物处于最小的变动和最少的干扰之中；动物进化的高级程度并不意味着所有器官和功能接近于人的程度；不能盲目使用近交系动物；查找文献并咨询动物实验所需动物和条件是否可行，了解前人所积累的经验，避免低水平的重复或缺乏科学依据的盲动所造成人力物力的浪费。影响动物实验的因素R=(A+B+C)×D+ER:实验动物的总反应A:动物种间的共同反应B:动物品种，品系特有的反应C:动物的个体反应D:环境因素（包括实验处理）E:实验误差A,B,C是由实验动物本身的遗传因素决定的，被选择的实验动物，在严格控制环境因素D或改变其中某一条件后就可能得到一个理想的实验结果R。动物对实验处理的反应可用以下公式表示：小鼠肝炎病毒感染裸鼠的肝脏病变wastesyndrome出现消耗性疾病，给肿瘤免疫学研究造成严重干扰实验动物方面仙台病毒感染仙台病毒感染肺病变对麻醉实验和吸入毒理学研究等产生严重干扰实验动物因素方面最适宜温度20-24℃，温差：3或4℃温度不同种类动物“热平衡”区的范围不同。在热平衡区，动物呈基础代谢率。如果环境温度降至低于热平衡区温度的下限，动物的代谢率将呈线性增长。如果环境温度高于热平衡区温度的上限，代谢率也将增长，这不是防御机制，而是由于环境温度导致体温升高，升高的体温提高了代谢率。因此，环境温度高于热平衡区比低于它使动物的应激反应更强烈。

环境因素方面湿度Ringtail:

Lowenvironmentalhumidity,hightemperatures,anddraftspredisposeyoungratsandmicetodevelopannularconstrictionsofthetailandoccasionallyfeetordigits.Localizededemacanleadtodrygangreneandtissuesloughing.环境因素方面噪声（Noise）噪音是实验动物发生应激反应的常见原因。引起动物紧张，导致不安和骚动。国家标准≤60dB超过100dB的噪声，能够引起某些品系的小鼠、大鼠和仓鼠发生抽搐；能够引起动物心跳、呼吸次数增加，引起大鼠血液甘油三酯水平升高和血压升高，而血糖降低；环境因素方面一个笼子中可以放多少只动物？经验告诉我们是每笼2-5只动物变异最低，动物单笼饲养变异高，当每笼动物数量超过5只时变异同样迅速攀升。饲养密度——每笼动物数（Numberofanimalspercage）环境因素方面饲养密度环境因素方面饲养密度身处狭小笼中，实验小鼠精神失常。英国和瑞士的研究人员曾安装一台24小时监控的摄像机，记录了实验小鼠的一举一动。老鼠们反复地做着同一动作。其中有些老鼠沿着笼子的不锈钢毫不费力地爬到顶部，前腿挂在天花板上，嘴则咬住笼栏，而后又跳到笼子底部。而另一只老鼠则在不停地翻跟斗，每秒钟一个，一口气能翻40分钟。它们每一个动作的目的就是为了不停地重复整套动作，而且做得那么认真执著，与精神病人的表现一模一样，毫无二致。环境因素方面势力范围

Malemicewillfightwhenfirstco-mingledinacage,andtheyneedtobeobservedverycloselyduringthistimeofestablishingasocialdominancehierarchywithinthegroup.Weakandnon-aggressiveanimalsmightbeinjuredorkilledifnotremovedfromthecage.环境因素方面

大多数动物已经形成了对人类的不信任，倾向于逃离人类。经过小心的捉拿操作和逐渐的适应，动物能够在某种程度上学会调整其逃走的本能。粗暴的捉拿操作和新的员工可再激活动物逃跑的本能，并可能影响到实验结果。环境因素方面Factorsinfluenceanimalexperimentsensitivityandreproducibility动物实验基本技术主要内容抓取与固定编号方法给药方法采血方法麻醉方法处死方法职业安全无害化处理AnimalRestraintMouse-AvoidgraspingandpullingthetipofthetailRatTailshouldbeliftedonlyatthebaseandforshortperiod,tailskinmaytearRestrainerofMiceandRatGuineapigHoldwithtwohandsRabbitUsetwohandsforliftingandshouldnotberestrainedbytheearsRestrainerofRabbitDog性别鉴定Furcoloring-picricacid染色法：一般适用于短期实验，大小鼠常用。原则：动物背部朝上头顶1、右前肢2、右侧腰部3、右后肢4、尾跟部5、左后肢6、左侧腰部7、左前肢8、背部9、不标号0或10

后面的数字永远大于前面的数字，如12、23、56、89、123、345等等；而没有11、21、43、65等等。Earpunching152金属耳号玻璃管动物标记(微芯片microchip)）1、可以标记的动物种类多2、体内标签，不易破坏3、使用寿命长，达到20年,可循环使用4、准确率高，读错率为10万分之一5、可以准确标记每一个动物动物标签编码规则3位国家代码+3位地区代码+12位动物标签编码如：国码：720区域：899序号：2玻璃管动物标签玻璃管动物标签注射器注射（植入）标签前一定要保证消毒到位，以避免不必要的感染玻璃管动物标签阅读器注射（植入）标签时应15-45度角注射，方便阅读器以之发生电磁感应，敏捷地读出数据。玻璃管动物标签阅读器的最佳阅读距离为7-12CM，不要太近或太远纹身皮下注射腹腔注射肌肉注射VeinInjectionofMouseVeinInjectionofRabbitVeinInjectionofDogGavagingMethodofMouseGavagingMethodofRabbitInjectionvolumeinmillilitersAnimalSCIMIVIPRat5-80.30.55-10Mouse2-30.20.052-3Hamster3-40.10.33-4G.P.5-100.50.55-8Rabbit30-500.5-11-550-100人与动物的给药量换算方法人与动物对同一药物的耐受性相差很大。一般情况下，动物的耐受性比人大，也就是单位体重动物的用药量比人要大。一般可按下列比例换算：人用药量为1；小鼠、大鼠为25-50；豚鼠、家兔为15-20；犬、猫为5-10。BleedingRequiringanesthesiaCardiacpunctureJugularveinPosteriorvenacavaLateralsaphenousvein(GP)NotrequiringanesthesiaOphthalmicvenousplexusTailveinEarveinCephalicvein(rabbit,dogs,cat)LateralsaphenousveinToe&tailclipingBleeding(cont.)Maximumamountofbloodthatcanbesafelyremovedforbloodcollection=1%ofbodyweight.Totalbloodvolumeisapproximately6%ofbodyweighte.g.5kgrabbitX1%=50mlbloodAnimalproduce0.75-1.0ml/kg/dayofblood5kgrabbit,1ml/kg=Xml/5kg,X=5ml/dayItwilltakes10daysfortheanimalstoreplacethe50mlthatwerewithdrawnOphthalmicvenousplexusCardiacpuncture实验动物的采尿方法代谢笼法：能将尿液和粪便分开而达到收集动物尿液目的的特殊装置。适用于大、小鼠。导尿法：适用于雄性兔、犬等。实验动物的麻醉(Anaesthesia)

动物麻醉目的：消除动物手术疼痛，便于实验操作，保证动物安全，为手术创造良好的条件。麻醉的意义：第一是善待动物，第二是提高动物实验的效率。全身麻醉：

局部麻醉：（普鲁卡因、利多卡因等）挥发性麻醉剂：吸入给药——乙醚、氯仿等非挥发性麻醉剂：静脉、皮下、肌肉、腹腔给药——氯胺酮、戊巴比妥钠等AnaesthesiaApparatus实验动物的安乐死(euthanasia)

指以人道的方法处死动物的过程。处死过程中尽量减少其惊恐和焦虑，使其安静地无痛苦的死亡。

安乐死必须符合的标准：1.死亡时尽可能减少惊恐、疼痛。2.使其在最短时间内失去意识迅速死亡。3.方法可靠且可重复。4.对操作人员安全。5.采用的方法要与研究的要求和目的一致。6.对观察者和操作者的情绪影响最小。7.对环境污染的影响最小。8.需要的机械设备简单，价廉，易操作。9.处死动物的地点应远离并与动物房分开。Euthanasia(cont.)-RodentsAcceptableInhalantanestheticoverdoseCOCO2BarbiturateoverdoseMicrowaveirraditationConditionallyacceptableN2(sedatedoranesthetized)ArgonCervicaldislocation(BW<200g)DecapitationEuthanasia(cont.)-UnacceptableHumaneconcernsDecompressionDrowningStrychnineForuseinconsciousanimalsExsanguinationRapidfreezingAirembolismSolemethodNicotineMagnesiumsulfatePotassiumchlorideAllcurariformagentsStunningHazardoustohumansChloroformCyanide常用脊椎动物安乐死方法说明：O:建议使用方法；N:不得使用方法；M:一般情况不推荐使用，除非实验需要。OccupationalHealthandSafetyProgramforPersonnelwithLaboratoryAnimalContactRiskAssessment:AllergiesBitesandScratchesSharpsinjuries(punctures,cuts,etc.)ChemicalExposureZoonoticDiseaseRespiratoryProtectionSHARPSIfneedlesareused,needlesarenottobepurposelybentorbrokenbyhand,removedfromdisposablesyringesorotherwisemanipulatedbyhand.Needlesshouldnotberecappedunlessabsolutelynecessary.Ifneedlesmustberecapped,asingle-handedtechniqueshouldbeused.SHARPSForsharpsthatposeadefinitepuncturepotential,anapprovedsharpscontainerisapunctureandleakresistantcontainer(i.e.,aredsharpscontainer).MemorialTowerforLaboratoryanimal如何做好动物实验？1、明确目的及必要性

首先要弄清其目的是什么,动物实验也不例外。只有明确动物实验的目的,才能避免实验的盲目性,真正做到有的放矢,少走弯路,节约经费和时间,从而达到科学、节俭和高效。2、确认必要性“3R”原则动物实验伦理和动物福利3、作好实验设计对照原则

随机化原则

重复原则均衡性原则如何做好动物实验？4、选择适宜的实验动物

5、做好实验操作和实验条件保障工作6、作好动物实验结果的统计、分析和资料的整理、归档工作研究论文中有关实验动物的描述(1)品