实验室验证大肠杆菌在土壤中的热耐受性及其影响因素,土壤污染论文

实验室验证大肠杆菌在土壤中的热耐受性及其影响因素,土壤污染论文随着人们生活水平的提高,公众对食品安全的关注越来越高,土壤的生物安全性也逐步进入人们的视野.细菌感染性疾病有很多是由于食用了被污染的新鲜水果或蔬菜而造成的[1-3].华而不实与土壤相关的病原体,如病原性大肠杆菌,十分是血清型为O157:H7的大肠杆菌(EscherichcoliO157:H7),可能给人们的身体健康带来严重的威胁[4-5].Wang等人发现,E.coliO157能在牛粪便存活长达70天[6],而牛粪等制成的堆肥施用于土壤,有可能造成土壤污染.当前,对E.coliO157的研究主要都集中在医学、水环境和有机废物上,但对土壤中大肠杆菌生存状况的研究则较少[7-9].本研究用环境污染指标菌--大肠杆菌作为研究对象,在实验室验证大肠杆菌在土壤中的热耐受性及其影响因素,以评估E.coliK12和E.coliO157的生存条件.1材料与方式方法1.1供试土壤采集的土壤在105℃下枯燥10h,在枯燥器中通过孔径1mm的筛子过筛后,放入试剂瓶中,在121℃高压锅中灭菌15min,最后储存在4℃的冷藏柜中以供使用.为了获得均匀稳定含水率的供试土壤,使接菌均匀,在大肠杆菌接种的前一天,在土壤中定量参加无菌蒸馏水,分别获得含水率70%和40%的两种供试土壤.1.2菌液的调制以E.coliK12菌株(非病原性,来自于日本佐贺大学农学部土壤环境研究室)和E.coliO157菌株(病原性,来自于日本产业医科大学产业保健院微生物研究室)作为供试菌株.接种前一天,将保存的E.coliK12和E.coliO157菌株接种在NB(Nutrientbroth)培养基上,在37℃下经18h和24h培养后,分别得到对数生长期(OD660,0.35mmol)和稳定生长期(OD660,0.50mmol)的菌液.上述菌液用离心机(9000g,12000rpm)离心10min后,除去菌液中的培养基,参加无菌生理食盐水(0.85%NaCl)制成菌体的悬浮液,调整至恰当的浓度(约109cfu/mL).1.3接种和细菌计数取100mLE.coliK12或E.coliO157的悬浮液(109cfu/mL),分别接种到0.9mL无菌生理盐水溶液、0.9g含水率为70%和40%的土壤中,浸入60℃恒温水浴中,受热时长分别为0、1、2、3、6和10min,进行热耐受性测定.热处理过的样品参加10mL无菌生理盐水,分散处理(15000rpm,15min)后,用无菌生理盐水稀释到适宜的浓度,接种到NA(NutrientAgar)培养基,在37℃下培养18~24h,计算菌数.2结果与讨论2.1不同条件下大肠杆菌的热耐受性接种到无菌生理盐水溶液土壤中的E.coliK12和E.coliO157在60℃条件下热耐受性如此图1所示.E.coliK12在对数生长期的情况下,从初始浓度108cfu/g下降到100cfu/g,在无菌生理盐水约需要2min,在含水率70%土壤中下降更慢,约需3min,而在含水率40%的土壤中,即便经过热处理10min后,仍有103cfu/g菌体存活(图1.A).类似的结果也发生在稳定生长期的菌体中,但是稳定生长期的E.coliK12菌体热耐受性明显高于一样的条件下的对数生长期菌体(图1.B).E.coliO157热耐受性的情况与E.coliK12类似,但其热耐受性比E.coliK12强,即E.coliO157的存活率更高层次(图1.C、D).综其结果,在高温条件下,大肠杆菌在含水率低的土壤中比在含水率高的土壤中热耐受性强,在稳定生长期的大肠杆菌比在对数生长期的热耐受性更强,E.coliO157菌株比E.coliK12菌株热耐受性更高层次.结果表示清楚,含水率大小是大肠杆菌热耐受性的重要影响因素,显示了在高温环境下,对大肠杆菌来讲,土壤含水率越低,存活率就越高.2.2D值的计算D值(Decimalreductiontime,DRT)是指一定的热力致死温度条件下细菌密度降低至初始密度的1/10所需的时间(即死亡90%所需时间).根据图1所示的热耐受性曲线,计算出E.coliK12和E.coliO157的D值如表1.在生理盐水、70%含水率土壤和40%含水率土壤中,60℃下对数生长期E.coliK12的D值分别为15.0、15.4和109.9sec,E.coliO157的D值分别为17.2、40.0和136.4sec.同样,在同一温度下的稳定生长期E.coliK12的D值分别为22.1、29.0和122.4sec,E.coliO157为30.4、61.6和215.9sec.40%含水率土壤中的大肠杆菌D值远高于在盐水中和70%含水率土壤中的大肠杆菌D值,稳定生长期大肠杆菌的D值比在对数生长期高.结果表示清楚,含水率40%土壤中的E.coliO157的D值是含水率70%土壤中的3倍,而E.coliK12则是3~6倍,换言之,在低含水率土壤中能够提高大肠杆菌的热耐受性,这表示清楚温度以外,适当的水分管理也同样重要.据报道,60℃致死温度下杀灭大肠杆菌的必要时间介于15~20min,55℃下需要1h[10].从上述得到的D值计算,大肠杆菌从108cfu/g下降到100cfu/g,E.coliK12需时16.3min,E.coliO157需时28.8min,与已有的报道大体一致.因而在理论上,所有的大肠杆菌细胞在土壤温度高于55℃时应该在几个小时后被杀灭,然而事实上,一些土壤环境中的大肠杆菌,即便温度高达54℃~67℃仍然能够存活下来[11],这用土壤含水率低和处在稳定生长期等理由还不能完全解释,可能还有其他影响因素,比方VBNC状态而导致大肠杆菌残存于土壤.3结论在热处理经过中,高含水率土壤中的大肠杆菌比低含水率土壤中的大肠杆菌热耐受性低,对数期大肠杆菌比稳定期的热耐受性低,E.coliK12比E.coliO157的热耐受性低.基于D值计算,E.coliK12和E.coliO157的完全致死时间分别是16.3min和28.8min.以下为参考文献:[1]CieslakPR,BarrettTJ,GriffinPM,etal.EscherichiacoliO157:H7infectionfromamanuredgarden[J].TheLancet,1993(342):367.[2]ChapmanPA,SiddonsCA,ManningJ,etal.Anoutbreakofinfectionduetoverocytotoxin-producingEscherichiacoliO157infourfamilies:theinfluenceoflaboratorymethodsontheoutcomeoftheinvestigation[J].Epidemiol.Infect,1997(119):113-119.[3]ItohY,Sugita-KonishiY,KasugaF,etal.EnterohemorrhagicEscherichiacoliO157:H7presentinradishsprouts[J].Appl.Environ.Microbiol,1998(64):1532-1535.[4]CoiaJE.Clincal,microbiologicalandepidemiologicalaspectsofEscherichiacoliO157infection[J].FEMSImmunologyandMedicalMicrobiology,1998(20):1-9.[5]KonumaH.Theconditionofmicrobiologicalcontaminationinvegetablesandpreventivemeasurement[J].Jpn.J.FoodMicrobiol.,2000(17):37-41.[6]WangG,ZhaoT,DoyleMP.FateofenterohemorrhagicE.coliO157:H7inbovinefeces[J].ApplEnvironMicrobiol,1996(62):2567-2570.[7]GafliardiJV,KarnsJS.LeachingofEscherichiacoliO157:H7indiversesoilsundervariousagriculturalmanagementpractices[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2000(66):877-883.[8]MauleA.SurvivalofverocytotoxigenicEscherichiacoliO157insoil,waterandonsurfaces[J].JournalofAppliedMicrobiologySymposiumSupplement,2000(88):71-78.[9]孙玉焕,杨志海.施污泥土壤中粪大肠菌群的动态变化及其环境卫生风险[J],青岛科技大学学报,2008(29):310-312.[10]DeportesI,Benoit-GuyodJ-L,ZmirouD.Hazardtomanandtheenvironmentposedbytheuseofurbanwastecompost:areview[J].TheScienceoftheTotalEnvironment,1995(172):197-222.[11]GongCM.Survivalofpathogenicbacteriaincompost