医学标书范文3

河南省科技攻关方案项目申请书姓名：JiangDongbao项目名称：FGFR4表达对结直肠癌细胞株生物学行为的影响及作用机制的争辩单位：郑州高校联系电话：填报说明请依据自己的专业及争辩方向，针对某具体临床问题，结合所学习临床科研方法的一种或几种写出一份科研设计。完成后，文件以个人姓名命名，发至：1736601711@。考核成果依设计书优略评定。截至日期2013年11月8日。一、项目的立项依据和意义（说明国内外相关领域技术进展水平和趋势等）结直肠癌（colorectalcancer，CRC）是起源于结直肠黏膜上皮的恶性肿瘤，是临床最常见的恶性肿瘤之一。我国每年结直肠癌新发病例超过25万，死亡病例约14万，新发与死亡病例均占全世界同期结直肠癌病例的20%[1]。局部进展期结直肠癌5年癌症相关生存率为70%，而发生远处转移的晚期结直肠癌5年生存率仅为12%，且生活质量低。目前结直肠癌新挂念化疗、挂念化疗、姑息化疗方案很多，如ECF、DCF、奥沙利铂+氟尿嘧啶、顺铂+氟尿嘧啶等，但其最核心的药物是氟尿嘧啶，在此基础上联合其他化疗药物。近年来，靶向药物在结直肠癌治疗领域的争辩和应用成为一大热点，作用于EGFR的爱必妥、作用于VEGF的贝伐单抗、针对Her-2的赫赛汀等已进入胃癌治疗的临床试验中。成纤维生长因子受体（FGFRs）是一个多基因家族,属免疫球蛋白基因超家族成员,是分布在多种细胞上的膜蛋白，FGFR家族成员有FGFR1、FGFR2、FGFR3以及FGFR4。它们的特点是在胞膜外含有3个免疫球蛋白样结构域，一个疏水的跨膜结构，胞浆内含有两个呈串联结构的酪氨酸激酶功能区。FGFR1～3在体内是广泛分布的,而FGFR4主要在发育早期大量表达,而且主要分布在视网膜和肾脏。编码FGFR4蛋白的FGFR4基因位于5号染色体，5q35.1-qter，基因编号为2264。FGFR4蛋白是一类具有自身磷酸化活性的跨膜酪氨酸激酶受体中的一种,在胚胎发育、组织修复和血管形成等进程中起着格外重要的作用[2,3]。但FGFR4在恶性肿瘤中的争辩相对较少，Pubmed检索该分子在胃癌中的争辩仅见几篇报道，而且争辩尚不深化。但有学者认为，FGFR家族是在恶性肿瘤诊治方面是一个新兴的领域，有宽敞的应用前景[4]。FGFR4在常见的恶性肿瘤如乳腺癌、胰腺癌、横纹肌肉瘤及肾细胞癌中均呈高表达[5-7]。MeijerD等报道FGFR4表达是复发性乳腺癌患者的独立的预后因素[8]；Milano等争辩亦认为FGFR4可以猜想三苯氧胺治疗乳腺癌的疗效[9]。Gowardhan等[10]争辩报道，与良性增生相比，FGFR4在前列腺癌中的表达显著上调；FGFR4的表达与Gleason评分相关；生存分析显示，FGFR4过表达与较差的预后相关，无病生存期缩短。HoHK等对57对肝细胞肝癌组织及对应的正常组织进行realtimePCR定量检测FGFR4在mRNA水平的表达，统计结果显示，FGFR4的表达与患者的主要临床病理资料无相关性，可能是由于样本量较小[11]。Streit等[12]通过免疫组化技术对137例恶性黑色素瘤组织标本进行FGFR4蛋白水平表达进行检测，结果显示，FGFR4在恶性黑色素瘤组织标本中的表达率为45%，FGFR4的表达与肿瘤临床分期、微溃疡形成、原发灶的数目、总生存期及无病生存期均有明显相关性，作者认为FGFR4蛋白的表达可作为恶性黑色素瘤进展的潜在指标。自2002年，Bange等[13]发觉了FGFR4Gly388Arg这一胚系多态性后，该SNP现已成为了一个争辩的热点。该SNP是位于FGFR4第9外显子388密码子上，碱基G转变为A，导致了FGFR4的氨基酸序列发生了变化，即388位氨基酸由甘氨酸转变为精氨酸，该位点位于FGFR4的高度保守序列中。据报道，FGFR4Arg388基因型并不影响肿瘤的发生过程，由于在乳腺癌患者及正常对比中，该SNP在两组中的分布比例大致相同，FGFR4Arg388基因型均占50%左右。但在淋巴结阳性的乳腺癌患者中，FGFR4Arg388基因型与更短的无病生存期和总生存期有关[14]。有报道显示，携带有Arg388等位基因的肺癌患者肿瘤发病年龄更早，差的临床分期的比例更高，生存期更短，所以FGFR4Gly388Arg可能猜想肺癌的预后[15]。这些发觉强调了该SNP位点具有临床意义，这一推断已在头颈部癌、前列腺癌、肺癌等恶性肿瘤中得以证明[3,16-18]。当然也有一些文献认为该SNP无预后价值。近来，一项随机的II期试验争辩中，257例T2-4/N0-2/M0原发性乳腺癌患者接受了阿霉素和环磷酰胺（AC）或阿霉素和培美曲唑（AP），序贯多西他赛（Doc）作为新挂念化疗，多因素分析显示，FGFR4Arg388是AC-Doc作为乳腺癌患者新挂念治疗方案病理性完全缓解的独立预后因素[19]。Sugiyama等发觉了MT1-MMP/FGFR4这个复合物，其中FGFR4R388等位基因可通过削减溶酶体对MT1-MMP的降解而增加对胶原蛋白的侵袭；通过siRNA下调MT1-MMP或FGFR4-R388均可阻挡细胞侵袭和生长[20]。近来一项meta分析显示，FGFR4Gly388Arg多态性与前列腺癌的进展相关，可作为前列腺癌的进展的一个分子标记[21]。在目前发觉的20余种成纤维生长因子（FGF）中，能与FGFR4结合的生长因子有FGF1,2,4,6,8,9,16,17,18和19。其中只有FGF19仅对FGFR4特异性结合[22]。且无论有无β-Klotho存在，FGF19均可与FGFR4结合而引起后续的生物学效应[23]。FGFR4的激活是FGF19促进肝细胞增殖，诱导肝癌形成的机制[24]FGFR4在在结直肠癌中的争辩甚少，故而本课题重点探讨了FGFR4的表达对结直肠癌细胞株的生物学行为的影响及作用机制。本争辩为了解FGFR4对结直肠癌细胞株生物学特性的影响，进行了体外功能试验，通过慢病毒转染技术下调FGFR4的表达，然后进行了一系列功能试验，包括增殖试验、克隆试验、侵袭试验、划痕试验、流式细胞仪检测细胞的凋亡和细胞周期的变化，westernblot检测凋亡及细胞周期相关蛋白在干扰前后的变化，初步探讨FGFR4影响结直肠癌细胞株生物学行为的机制。1.InternationalAgencyforResearchOnCancer.WorldHealthOrganization.GLOBOCAN2012:EstimatedCancerIncidence,MortalityandPrevalenceWorldwidein2012[EB/OL][2014-12-5].2.EswarakumarVP,LaxI,SchlessingerJ.Cellularsignalingbyfibroblastgrowthfactorreceptors.CytokineGrowthFactorRev2005;16:139–49.3.WangJ,StocktonDW,IttmannM.Thefibroblastgrowthfactorreceptor-4Arg388alleleisassociatedwithprostatecancerinitiationandprogression.ClinCancerRes2004;10:6169–78.4.KatohM.GeneticalterationsofFGFreceptors:anemergingfieldinclinicalcancerdiagnosticsandtherapeutics.\o"Expertreviewofanticancertherapy."ExpertRevAnticancerTher2010;10:1375-9.5.JacquemierJ,AdelaideJ,ParcP,etal.ExpressionoftheFGFR1geneinhumanbreastcarcinomacells.IntJCancer1994;59:373-86.LeungHY,GullickWJ,LemoineNR.Expressionandfunctionalactivityoffibroblastgrowthfactorsandtheirreceptorsinhumanpancreaticcancer.IntJCancer1994;59:667-75.7.TakahashiA,SasakiH,KimSJ,etal.Identificationofreceptorgenesinrenalcellcarcinomaassociatedwithangiogenesisbydifferentialhybridizationtechnique.BiochemBiophysResCommun1999;257:855-9.8.MeijerD,SieuwertsAM,LookMP,etal.Fibroblastgrowthfactorreceptor4predictsfailureontamoxifentherapyinpatientswithrecurrentbreastcancer.\o"Endocrine-relatedcancer."EndocrRelatCancer.2008;15:101-11.9.MilanoA,DalLagoL,SotiriouC,etal.Whatcliniciansneedtoknowaboutantioestrogenresistanceinbreastcancertherapy.EuropeanJournalofCancer2006;42:2692–705.10.GowardhanB,DouglasDA,MathersME,etal.Evaluationofthefibroblastgrowthfactorsystemasapotentialtargetfortherapyinhumanprostatecancer.\o"Britishjournalofcancer."BrJCancer.2005;92:320-7.11.HoHK,PokS,StreitS,etal.Fibroblastgrowthfactorreceptor4regulatesproliferation,anti-apoptosisandalpha-fetoproteinsecretionduringhepatocellularcarcinomaprogressionandrepresentsapotentialtargetfortherapeuticintervention.JHepatol.2009;50:118-27.12.StreitS,MestelDS,SchmidtM,FGFR4Arg388allelecorrelateswithtumourthicknessandFGFR4proteinexpressionwithsurvivalofmelanomapatients.\o"Britishjournalofcancer."BrJCancer.2006;94:1879-86.13.BangeJ,PrechtlD,CheburkinY,etal.CancerprogressionandtumorcellmotilityareassociatedwiththeFGFR4Arg(388)allele.CancerRes2002;62:840-47.14.ThussbasC,NahrigJ,StreitS,etal.FGFR4Arg388alleleisassociatedwithresistancetoadjuvanttherapyinprimarybreastcancer.\o"Journalofclinicaloncology:officialjournaloftheAmericanSocietyofClinicalOncology."JClinOncol2006;24:3747-55.15.SpinolaM,LeoniV,PignatielloC,etal.FunctionalFGFR4Gly388Argpolymorphismpredictsprognosisinlungadenocarcinomapatients.JClinOncol2005;23:7307-11.16.MaZ,TsuchiyaN,YuasaT,etal.Polymorphismsoffibroblastgrowthfactorreceptor4haveassociationwiththedevelopmentofprostatecancerandbenignprostatichyperplasiaandtheprogressionofprostatecancerinaJapanesepopulation.IntJCancer2008;123:2574-9.17.FalvellaFS,FrullantiE,GalvanA,etal.FGFR4Gly388Argpolymorphismmayaffecttheclinicalstageofpatientswithlungcancerbymodulatingthetranscriptionalprofileofnormallung.IntJCancer2009;124:2880-5.18.TanumaJ,IzumoT,HiranoM,etal.FGFR4polymorphism,TP53mutation,andtheircombinationsareprognosticfactorsfororalsquamouscellcarcinoma.OncolRep2010;23:739-44.19.MarméF,WerftW,BennerA，etal.FGFR4Arg388genotypeisassociatedwithpathologicalcompleteresponsetoneoadjuvantchemotherapyforprimarybreastcancer.AnnOncol2010;21:1636-42.20.SugiyamaN,VarjosaloM,MellerP,etal.Fibroblastgrowthfactorreceptor4regulatestumorinvasionbycouplingfibroblastgrowthfactorsignalingtoextracellularmatrixdegradation.\o"Cancerresearch."CancerRes.2010;70:7851-61.21.XuB,TongN,ChenSQ,etal.FGFR4Gly388Argpolymorphismcontributestoprostatecancerdevelopmentandprogression:Ameta-analysisof2618casesand2305controls.\o"BMCcancer."BMCCancer2011;1:84.22.XieMH,HolcombI,DeuelB,DowdP,HuangA,VagtsA,FosterJ,LiangJ,BrushJ,GuQ,HillanK,GoddardA,etal.FGF-19,anovelfibroblastgrowthfactorwithuniquespecificityforFGFR4.Cytokine1999;11:729–35.23.Wu

X,

Ge

H,

Lemon

B,

et

al.

Selective

activation

of

FGFR4

by

an

FGF19

variant

does

not

improve

glucose

metabolism

in

ob/ob

mice.

Proceedings

of

the

National

24.XinleWu，HongfeiGe，BryanLemon,etal.FGF19-inducedHepatocyteProliferationIsMediatedthroughFGFR4Activation.Journalofbiologicalchemistry2010;285:5165-70.二、项目创新点、主要争辩开发内容及目标（实施方案、技术关键、技术路线和技术经济指标等）1.实施方案（1）设计4个FGFR4RNAi靶点构建到慢病毒载体，进而小量包装秤病毒颗粒。然后感染SW620和HCT116结直肠癌，通过定量PCR和Westernblot法检测FGFR4在mRNA和蛋白水平的表达，筛选出干扰效果最佳的siRNA，进行大量包装，形成FGFR4siRNA稳定转染的细胞株，FGFR4持续低表达；构建FGFR4过表达慢病毒载体，进而包装成病毒颗粒,然后感染结直肠癌细胞株，形成FGFR4过表达细胞株，FGFR4持续高表达，以备后续功能试验。2.对FGFR4siRNA稳转细胞株和FGFR4过表达细胞株，分别以各自未行处理的细胞株作为对比，进行一系列的体外功能试验，以评价FGFR4的上调和下调对结直肠癌细胞生物学行为的影响，包括增殖试验、克隆试验、侵袭试验、凋亡试验及细胞周期的变化；同时在分子水平进行Westernblot检测，以显示不同处理后，细胞增殖、侵袭、凋亡及细胞周期相关蛋白表达的变化，如MMP-2、p27、CyclinD1及Bcl-xl等。3.分别将FGFR4siRNA稳转细胞株、FGFR4过表达细胞株和相应的未处理的结直肠癌细胞株皮下注射至裸小鼠（nu/nu）背部,构建成裸小鼠结直肠癌模型。接种6-8周后，观测不同处理组成瘤体积、大小等增殖指标的变化；对裸小鼠结直肠癌组织行免疫组化检测，以了解不同处理组肿瘤细胞生物学特性相关分子表达的变化。2．争辩方法和争辩手段：1.标原来源：结直肠癌细胞株HCT116、SW620、DLD1、SW116、LS47等均购自上海中科院细胞所或ATCC，按说明书培育，利用DMEM培育基、Gibico美洲胎牛血清、100IU/ml青霉素及100ug/ml链霉素等培育细胞。BALB/c（nu-nu）裸小鼠拟购自科学院上海药物争辩所，合格证编号：沪动合证字122号；日龄：28-32天；体重16-20；饲养于SPF级环境中。用于FGFR4RNAi和过表达试验的慢病毒载体拟购自上海基凯公司。2．利用软件设计3-4个FGFR4RNAi靶点，构建到慢病毒载体上，进而包装成病毒颗粒，然后感染FGFR4高表达的结直肠癌细胞株，经RT-PCR和Westernblot验证干扰效率，制备成FGFR4RNAi稳转细胞株。同样，运用慢病毒载体构建FGFR4过表达结直肠癌细胞株。3.利用流式细胞仪、CCK-8及侵袭小室等对FGFR4RNAi稳转株和FGFR4过表达细胞株进行体外功能试验，包括增殖试验、克隆试验、侵袭试验、凋亡试验及细胞周期的变化；同时在分子水平进行Westernblot检测结直肠癌生物特性相关分子表达的变化。4．将FGFR4RNAi稳转株、FGFR4过表达细胞株及相应的未感染细胞株分别皮下注射入裸小鼠背部，构建成裸鼠结直肠癌模型，进行体内试验。观测成瘤体积等细胞增殖指标，利用免疫组化技术检测FGFR4不同表达的裸鼠结直肠癌模型相关分子表达的变化。3.技术路线见图一有效靶点大量包装有效靶点大量包装设计4个FGFR4基因RNAi靶点构建到慢病毒载体载体小量包装慢病毒颗粒感染HCT116、SW620结直肠癌细胞株FGFR4mRNA和蛋白质的表达干扰效率满足FGFR4基因过表达慢病毒载体构建过表达载体小量包装慢病毒颗粒感染结直肠癌细胞株FGFR4mRNA和蛋白的表达qPCR和WesternBlotFGFR4过表达满足基因功能争辩成瘤的体积、大小等增值指标的评价肿瘤组织MMP-2、p27、CyclinD1、BCL-xl表达的变化MMP-2、p27、CyclinD1、BCL-xl表达的变化增值、侵袭、凋亡、细胞周期变化等试验InvivoInvitro裸鼠结直肠癌模型的构建图一4.技术关键本课题关键技术在于FGFR4RNAi慢病毒载体的构建及FGFR4RNAi稳转结直肠癌细胞株的建立；FGFR4过表达慢病毒载体的构建及FGFR4过表达结直肠癌细胞株的建立；FGFR4不同表达的裸小鼠结直肠癌模型的构建；一系列体外功能试验、体内功能试验及相关分子检测，探讨FGFR4在结直肠癌发生进展中的作用三、实施本项目已具备的条件（说明已具备的试验手段、技术力气、前期科研基础状况）（1）本课题申请人可独立进行的试验操作主要包括：新颖标本DNA和RNA的抽提和测定；RT-PCR及realtimePCR的操作和结果分析；免疫组化技术的操作和结果分析；细胞培育技术；蛋白抽提、浓度测定、westernblot检测靶分子蛋白表达及结果分析；siRNA瞬时转染技术及转染效率测定；CCK-8法检测细胞增殖试验。流式细胞术的检测，细胞免疫荧光技术在试验室老师帮忙下完成。（2).慢病毒构建RNAi载体及过表达载体，是一些格外成熟的技术，FGFR4RNAi稳转株和FGFR4过表达细胞株的建立可请上海吉凯公司帮忙完成，而该公司为专业从事介导靶分子上调和下调病毒载体的制备和包装，已和前期争辩所在试验室有过多次成功合作先例；而构建裸小鼠肿瘤模型亦是一项常用的争辩技术，可请相关老师指导完成。（3）本课题在叶延伟老师的带领下进行，叶老师在复旦高校附属肿瘤医院攻读肿瘤学博士学位，期间在复旦高校试验争辩中心进行了为期1年的博士课题试验部分的争辩，独立完成了一系列试验操作，试验结果已经发表。硕博连读期间以第一作者发表SCI论著5篇，最高IF为5.131分，累计IF达18分，分别发表于Cancer、Cancerletters、Annalsofsurgicaloncology、Journalofsurgicaloncology、digestivesurgery；此外，以共同作者发表国内外论著10余篇。郑州高校附属第一医院重点试验室韩超老师赐予试验技术方面的挂念，韩老师是郑州高校的在职博士，试验技术精湛，阅历丰富。（4）.郑州高校第一附属医院重点试验室试验设备齐全，各个试验领域均有专业试验指导员，为该争辩顺当实施供应了很好的平台。四、项目的预期经济、社会和环境效益FGFR4在结直肠癌中的争辩很少，而且不够深化。本课题利用慢病毒载体构建FGFR4RNAi稳转结直肠癌细胞株和FGFR4过表达细胞株，分别下调和上调FGFR4分子的表达，进行一系列的体内和体外功能试验，从而更全面、多角度地阐述FGFR4在结直肠癌发生进展中的作用，为结直肠癌新的治疗靶点的筛选供应一些依据，目前国内外文献尚未见相关报道。五、项目实施的方案进度1.2016年1月-2016年6月：1）结直肠癌细胞株的培育,包括HCT116、SW620及其他常见结直肠癌细胞株；筛选出FGFR4高表达和低表达结直肠癌细胞株。2）FGFR4RNAi慢病毒载体的构建与包装,结直肠癌细胞株SW620、HCT116的感染,qPCR和w