枸杞多糖对淋巴细胞功能的影响

枸杞多糖对淋巴细胞功能的影响第1页/共22页最近,国内外学者提出生物反应调节(BRM)的概念,强调在肿瘤放化疗及手术治疗的同时应用BRM不但能提高患者的免疫功能,还可减轻上述治疗对免疫系统及造血系统的损害,从而提高治疗效果。在我国,中药取自天然,来源广泛,容易获得,不良反应小。为此,本实验试图对枸杞多糖免疫调节作用进行研究,研究其对外周血淋巴细胞增殖及功能的影响。第2页/共22页第3页/共22页第4页/共22页摘要为研究枸杞多糖(LBP)对正常人外周血淋巴细胞免疫调节功能的影响，通过无菌分离人外周血淋巴细胞,加入植物凝集素(PHA)和不同质量浓度LBP,MTT法检测其对淋巴细胞增殖的影响;ELISA法检测LBP作用后淋巴细胞培养上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达情况，来研究枸杞多糖对外周血淋巴细胞增殖及功能的影响。关键词枸杞多糖;外周血;淋巴细胞;增殖;抗肿瘤;免疫功能第5页/共22页一.实验原理枸杞多糖(LBP)是传统中药材枸杞的主要成分之一,由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖6种单糖组成。而实验证明多糖成分(如云菇多糖、灵芝多糖等)可通过激活机体的免疫系统来达到抗肿瘤的目的[1-2],目前对于枸杞多糖抑制肿瘤的免疫调节作用及免疫机制尚不十分清楚。第6页/共22页PHA是T细胞非特异性有丝分裂原,能与T细胞表面CD3/TCR复合体结合,导致包括CD3+、CD4+、CD8+以及LAF-1等细胞表面分子磷酸化,通过激活PKC途径引起细胞活化。TNF-α能够直接杀死病毒和肿瘤,在CD8+T的成熟阶段发挥着重要的信号作用,TNF-α缺乏时会导致效应性CD8+T细胞产生下降,影响其转化为记忆性T细胞。可见,TNF-α除了对肿瘤细胞具有直接毒性和生长抑制作用外,还可以通过增强CD8+T细胞的细胞毒作用抵抗肿瘤的生长。第7页/共22页本实验主要是以枸杞多糖为材料来研究其对人外周血淋巴细胞免疫调节作用,为进一步开发增强免疫力的抗肿瘤药物提供参考。第8页/共22页二、实验材料与分组

1.材料健康人外周血采自20～30岁健康志愿者。枸杞多糖由本校实验中心从优质枸杞子中分离提取,纯度为99%。RPMI-1640为Gibco公司产品。植物凝集素（PHA)、MTT试剂均为Sigma公司产品。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、ELISA试剂盒购自晶美生物工程有限公司。淋巴细胞分离液为上海生化试剂二厂产品。胎牛血清(FBS)为杭州四季青公司产品。第9页/共22页2.

分组据实验孔中加入枸杞多糖质量浓度的不同以及加入或不加PHA将实验分为对照组、PHA组、枸杞多糖组、PHA＋枸杞多糖组。第10页/共22页三、实验方法

1.

人外周血淋巴细胞的分离和增殖反应取健康人外周血约5mL,肝素抗凝,加入等体积PBS混匀,用淋巴细胞分离液经密度梯度离心法分离外周血单核细胞(PBMC)取白细胞层用PBS洗涤2次,加入含10%FBS的RPMI-1640培养基,置于饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱中培养2h。第11页/共22页未贴壁细胞为淋巴细胞,将其重悬于培养液中,2%台盼蓝试验证实细胞存活率>95%,调整浓度为2×109L-1。加入96孔板中,每孔100µL,实验孔加入不同质量浓度的枸杞多糖,加入或不加PHA,枸杞多糖终质量浓度分别为100,80,60,50µg/L,每组均设4个复孔。常规培养72h,各孔加入MTT(5g/L)20µL,培养过夜,离心弃去培养上清,每孔加入DMSO150µL,混匀后以测定波长570nm、参考波长620nm检测各孔吸光度(A)值,并计算增殖指数。增殖指数=实验组A值/对照组A值×100%。将所测及计算结果记录于表一。第12页/共22页

表一各组外周血淋巴细胞增殖情况比较（x±s,n=4）

组别浓度/（㎎/L）A值增值指数对照组－

PHA组0.050

枸杞多糖组50

60

80

100PHA＋枸杞多糖组50+0.050

60+0.050

80+0.050

100+0.050第13页/共22页2.TNF-α的测定按1项方法培养淋巴细胞,所得到的培养上清用ELISA法测定TNF-α水平,在酶标测试仪上测定570nm处A值。根据标准曲线计算出培养上清液中细胞因子的量。将所测及计算结果记录于表二。第14页/共22页表二各组外周血淋巴细胞产生TNF-α情况比较组别浓度/（㎎/L）TNF-α（µg/L）对照组－

PHA组0.050

枸杞多糖组50

60

80

100（x±s,n=4）

第15页/共22页

3.

统计学处理采用SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析和LSD,实验结果用x±s表示。第16页/共22页四、结果预测

1.枸杞多糖对人外周血淋巴细胞增殖的影响采用MTT法检测发现，在50~100mg/L质量浓度下,枸杞多糖可单独诱导淋巴细胞活化和增殖,并且在PHA的作用下枸杞多糖可显著促进PHA活化的淋巴细胞增殖(P<0.01)。第17页/共22页2.枸杞多糖对人外周血淋巴细胞TNF-α产生的影响采用ELISA法检测发现，PHA对淋巴细胞产生TNF-α没有明显影响(P>0.05),经枸杞多糖作用后,淋巴细胞产生的TNF-α水平显著升高(P<0.01),且有明显的量效关系。第18页/共22页五、结果分析1.枸杞多糖与PHA协同作用使得淋巴细胞显著增殖，可能是因为枸杞多糖强化了PHA活化作用,促进淋巴细胞进入增殖周期而发生增殖。2.如果实验结果与此不同或相反，可能与以下原因有关：人体的个体差异使得其免疫功能不同，从而影响实验结果；实验操作手法及过程也可能对实验结果产生影响。第19页/共22页参考文献[1]何燕,吴雄志.中药多糖的免疫调节作用[J].四川中医,2001,19(2):15-17[2]王学宏,李明春.中药多糖的免疫及抗肿瘤作用研究进展[J].