流式细胞仪及其应用指南

流式细胞仪及其应用指南第1页/共99页流式细胞仪标本处理一般原则及方法流式细胞仪使用一般方法及技巧流式细胞仪原理介绍第2页/共99页双光源系统流式细胞仪第3页/共99页第4页/共99页在管道大约50倍直径距离处，鞘液中心速度与边缘速度达到稳定，形成稳定的层流。样本与鞘液未入管道时，边缘与中心速度一致。进入管道后，受管壁粘性阻力边缘速度下降，中心速度不变。流体形成层流后，会产生流体聚焦效应，所有颗粒均被推致流速最快的液流中。颗粒以衡定的速度作匀速运动。第5页/共99页无论每秒检测数量为多少，颗粒经过检测区的速度是衡定的第6页/共99页第7页/共99页流式细胞仪标本准备染色的一般原则及方法第8页/共99页标本来源：外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他。根据各种具体实验，选用不同的抗凝剂。可用的抗凝剂如下：EDTA：2mg/ml枸椽酸钠：0.38%肝素：15IU/ml第9页/共99页标本处理时间：新鲜样本分析时，样本采集后应立即分析样本固定方法：1%的多聚甲醛或75%的酒精，作用30分钟。注：不同的实验，所用的固定方法不完全相同。第10页/共99页样本处理标准试剂：一、10%BovineSerumAlbuminBSA1.溶解10gBSA至100ml蒸馏水中2.4ºC，20000g离心30分钟3.分装后-20ºC保存第11页/共99页二、0.1%BSA-PBS缓冲液1.准备500ml，PH7.3PBS2.加入5ml10%BSA3.使用0.45um滤网过滤三、氯化铵溶血剂1.在一升蒸馏水中溶解8.29gNH4CL,1gKHCO3和37mgNa2EDTA2.调节PH值至7.23.在使用前配置该溶血剂，并用0.45um滤膜过滤第12页/共99页方法一：溶血法取100ul抗凝全血；2.快速加入2mlNH4CL溶血剂,混匀；3.室温孵育10分钟；4.4ºC，400g离心10分钟。去上清，加入2mlBSA-PBS；5.4ºC，400g离心10分钟。去上清，加入2mlBSA-PBS；6.4ºC，400g离心10分钟。去上清，调整细胞浓度至5x106/ml。富集白细胞第13页/共99页注：化学试剂直接作用于红细胞的溶血剂有：以草酸为主的溶血剂（CoulterQ-Prep），基于NH4CL的BD公司的FACSLyse溶血剂。优点：溶血时间快？？？，在流式细胞仪上可清楚地将淋巴、单核、粒及红细胞碎片相区分。缺点：需严格掌握溶血时间，对白细胞表面抗原有影响，随时间细胞形态变化大。第14页/共99页方法二：密度离心法提取单个核细胞Histopaque1077为Ficoll与Sodiumdiatrizoate(泛影酸钠)混合物，其密度为1.119～1.077。通过离心可将全血中的粒细胞与单个核细胞分离。粒细胞沉积于1.119～1.077的血浆层，而单个核细胞则在1.077以下的血浆层中。第15页/共99页1.准备2ml抗凝血（根据实验要求确定用血量），等量PBS稀释；2.准备1mlHistopaque1077(Sigma)；3.室温下700g离心30分钟；4.仔细将含有单个核细胞血浆层吸出；5.加4mlBSA-PBS，400g离心10分钟；6.加2mlBSA-PBS清洗2次。操作第16页/共99页

淋巴节、扁桃体、脾、胸腺等淋巴组织由于结构松散，容易分离成单个细胞。一般对样本进行切剪、研磨、过滤便可。从组织获取淋巴细胞将样本置于陪替氏培养皿，加入15mlBSA-PBS；将样本切成3-4mm3大小，用镊子将其分离；将样本经滤网过滤，用密度法分离、提纯淋巴细胞。方法：第17页/共99页其他标本：通常在其他组织中分离淋巴细胞需用酶进行消化。对于不同标本，处理方法也各不相同。制备大鼠肾脏浸润细胞解剖刀、CO2孵育箱、滤网以及含1mg/ml胶原酶的细胞培养液（无血清）材料：第18页/共99页方法：1.将样本置于皮氏培养皿，用解培刀切成小块；2.加入10ml胶原酶溶液，37ºCCO2培养箱孵育30分钟；3.滤网过滤；4.密度梯度法离心提纯淋巴细胞。第19页/共99页其他类型细胞

在组织中提取细胞通常使用酶消化法。同样对于不同组织处理方法也各异，以下是讲述通用的胶原酶消化法制备组织细胞。改良后的此法尚可用于制备人、鼠上皮细胞。第20页/共99页材料

解剖刀0.15%胰蛋白酶Hanks’s缓冲盐或PBS，pH7.3不含Ca、Mg离子的HBSSII型胶原酶1%BSA或5%FBS5ml的吸样管35um尼龙滤网DNase第21页/共99页

将样本置于皮氏培养皿，加15mlBSA-PBS，将样本切成1mm3大小，用镊子将其分离；

HBSS或PBS洗清加入10ml无Ca、Mg离子0.2%II型胶原酶溶液0.02%DNase1的HBSS；

37ºC摇床上孵育15~60分钟，视样本类型而定；操作第22页/共99页用5ml的吸样管反复吹打，制成单个细胞悬液；使用35um滤网过滤，300g离心5分钟；用PBS或细胞培养液重悬样本；对于某些样本过滤后仍有小块组织，重复第5步获取细胞，重复第7步；用含0.15%胰酶、0.02%DNase1不含Ca、Mg的HBSS重悬，37ºC孵育一段时间加入1%BSA或5%FBS，灭活酶活性。第23页/共99页细胞培养

许多原代细胞和培养细胞系，都为贴壁型生长。通常先用胰酶处理获得单细胞悬液，需注意消化过度会损害细胞，特别是改变其表面抗原标记。准备单细胞悬液1.仪器和试剂：

0.25%rEDTA,pH7.20.25%的胰酶10%血清的培养液2.方法：

a.PBS洗涤细胞；

b.加入0.25%有胰酶，37ºC处理2~8分钟；

c.倒置显微镜下观察，至大部分细胞脱落悬浮后，加入含10%血清的培养液。

d.PBS液洗涤细胞，最后配成终浓度为1×106/ml

的细胞悬液。第24页/共99页样本处理第25页/共99页抗体染色一般方法外周血白细胞分析：100ul全血血小板分析：1~5ul全血（根据样本血小板数量）红细胞分析：1ul全血（根据样本中红细胞数稀释后使用）骨髓：100ul其他样本，计数后决定使用体积目标细胞数量及检测终浓度：1×106/ml第26页/共99页细胞计数方法传统手工计数：耗时、准确度差流式细胞仪计数：BD，Coulter仪器：高速4ul/秒，中速2ul/秒，低速0.5ul/秒？partec仪器:最为精密的细胞计数器，直接报告细胞浓度第27页/共99页反应体积样本中加完抗体后，1×106细胞反应体积应不小于100ul。第28页/共99页抗体染色最为普通的抗体染色原则：1×106细胞对1ug抗体（抗体供应商所推荐使用单位），此浓度90%处于过饱合状态精确使用：滴定抗体，抗体对于抗原恰达到饱合浓度第29页/共99页SPECIFICANTIBODYNON-SPECIFICANTIBODYCONCENTRATIONAMOUNTBOUND抗体滴定原理第30页/共99页流式细胞仪抗体滴定方法33µgs/n=2.51µgs/n=2.10.3µgs/n=2.40.1µgs/n=4.10.03µgs/n=4.80.01µgs/n=4.60.003µgs/n=3.50.001µgs/n=3.2auto第31页/共99页65432100102030405060DilutionSignaltoNoiseTITER第32页/共99页孵育、溶血、固定抗体孵育：室温下避光15分钟（某些情况下如：细胞内因子检测需冰育）溶血：如样本含中有红细胞需溶血（见下页）样本溶血后需立即上机检测，固定后可放置较长时间第33页/共99页第34页/共99页白细胞保护型溶血剂Cal-Lyse(其中已含细胞固定剂)：1，100ul外周血，加入100ul溶血剂2，混匀后，室温下孵育10分钟3，加入2ml蒸馏水，混匀后室温下孵育10分钟4，根据实验需要，免洗直接上机检测或400g离心10分钟后PBS重悬优点：试剂为温和型溶血剂，不影响细胞表面抗原及溶血时间无需精确把握第35页/共99页各溶血剂性能比较第36页/共99页第37页/共99页第38页/共99页抗体标记荧光素及其他荧光染料荧光激发及发射原理能量级激发激发态发射激光能量损失第39页/共99页标记抗体常用荧光素FITC激发光：488nm发射光：525nm;使用面最广，价格便宜AlexaGreen具有更佳的能量转移效率及更纯的发射光谱第40页/共99页PE激发光488nm发射光575nm此荧光的激发效率最佳，故此荧光得到的信号最强检测某些弱表达的抗原，推荐使用此荧光素价格较FITC昂贵第41页/共99页PE-Cy5TC激发光488nm,发射光667nm为复合荧光素，荧光激发较率较高，信号强FTIC、PE、PE-Cy5三者为流式细胞最为常的荧光，并经常将三者共同使用进行三色分析第42页/共99页PE-Cy7激发光488nm，发射光767nm为复合荧光素，2000年后被开发出来，激发效率佳与前三者联进可进行单激光四色分析（488nm），光谱之间影响较小第43页/共99页APC激发光633nm，发射光660在配有双激光的流式细胞仪上，此荧光染料与FITC、PE、PE-Cy5联用做四色分析。但现在因单激光四色可实现，故使用该染料意义不大。第44页/共99页核酸染料第45页/共99页细胞膜电位、离子、脂类探针现已发现或开发出来了各种细胞膜电位、各类离子、pH值、脂类探针，运用这些探针在流式细胞仪上可轻易检测各种细胞功能，可实现一些异想不到的效果。详细信息，见细胞探针公司网站：

www.molecularP第46页/共99页与流式细胞仪相关的荧光术语MESF（Moleculesofequivalentsolublefluorochrome）等量可溶性荧光分子：国际标准单位，用来衡量荧光强度自发荧光：细胞或颗粒在激发照射下会发出各种波长的荧光。白细胞自发荧光强度为650~1150MESF，血小板及其他颗粒自发荧光更低流式细胞仪精度：分析白细胞要求精度在1000MESF以内，分析其他细胞或颗粒需要更高的精度：300MESF以内第47页/共99页第二部分流式细胞仪使用一般方法及技巧第48页/共99页上机检测样本染色及溶血过程处理完后应立即上机检测打开流式细胞仪：预热及进行质控程序选择相应的方案或新建方案加载或重新调节各参数上样检测第49页/共99页技巧一：定位目标细胞群体寻找细胞群：如标本为外周血，在FS/SS散点图中信号最强的为粒细胞，依次为单核、淋巴、红细胞碎片。要寻找淋巴细胞，可首先调低FS/SS电压定位粒细胞后逐步调高电压依次寻找各细胞群。使用目标群所特有的表面标志物结合SS信号，可最快、最特异性地定位目标细胞群如标本中无明显特征细胞群，可使用已建淋巴细胞检测方案根据相对位置定位目标细胞群第50页/共99页技巧二：阴性对照阴性对照作用：调节PMT电压；设立阴、阳性界线使用抗体相应同型荧光免疫球蛋白作为阴性对照，注对照及抗体需出自同一厂家（检测一过性样本中的某些指标）使用对照组样本作阴性对照（与其他实验中对照组含意相同，但此时仍需使阴性对照初始化仪器）对与非抗体染色，如各类核酸染料或探针：PI、ANNEXIN-V。使用空白标本作为阴性对照，或设立阳性对照。第51页/共99页技巧三：常见故障及解决时刻注意鞘液及废液桶液量，熟悉仪器各类报警信号通过软件操作仪器，很少能引起仪器硬件固障如样本中有可见颗粒，建议过滤后再检测如仪器经常不使用，管道会结晶、长菌、堵塞、漏气，此时叫工程师便可解决如仪器出现硬件故障，通常是仪器自身问题，与操作者无关第52页/共99页技巧四：检测指标检测前要清楚地知道：除阳性百分比指标外，还有荧光强度指标。后者往往比前者更有意义检测时，灵活应用放大模式：线性或对数（如指标相差不大，使用线性放大，如：SS、FS；一般荧光参数使用对数放大）灵活运用门的逻辑关系及颜色示踪功能，可使检测结果更为明了合理选择不同的荧光素标记试剂，以最少的投入获取最多的信息第53页/共99页荧光补偿：极其重要的操作第54页/共99页FITC与PE第55页/共99页调与未调补偿FL1FL2第56页/共99页补偿调节原理第57页/共99页补偿调节原理第58页/共99页双色荧光补偿调节标准方法：第一步IgGFITC/IgGPE通过调节电压使阴性群体落在FTIC及PE双阴性区注在进行调补偿时必须将原补偿全部归零第59页/共99页双色荧光补偿调节标准方法：第二步FITC标记抗体/IgGPE第60页/共99页双色荧光补偿调节标准方法：第三步通过补偿设置按钮增、减补偿百分数第61页/共99页因为：第62页/共99页所以：第63页/共99页注意！用来调节补偿的FITC、PE抗体必须有明显的阳性信号，否则就不会出现荧光渗漏现像，调节补偿也无从入手。在正式数据采集前要调整好补偿，一旦数据被获取，BD、Coulter仪器无法再改变补偿partec流式细胞仪提供软件调节补偿技术，无论何时都可重新调节多色荧光补偿调节方法同双色法第64页/共99页复杂方案分析了解流式仪胞仪各参数的意义熟悉设门操作开扩思路，灵活设计各种检测方案第65页/共99页流式细胞仪CD34阳性干细胞计数标准方案：ISHAGE背景知识：外周血现已被广泛地被用作骨髓移植癌症患者接受大剂量化疗或放疗后骨髓重建造所需血干细胞HemotopoieticProgenitorCellsHPC的来源外周血源性干细胞现主要被运用自体移植其应用面也逐步拓展至异基因骨髓移植中。运用流式细胞仪可最早监测外周血中是否有足够的干细胞供采集。由于此类样本中，碎片、血小板、聚集物对检测结果影响较大，故设计了ISHAGE方案去除这些影响。第66页/共99页CD34计数中的问题溶血剂：避免溶血时间过长，处理完成后将样本置于冰水中，将降低溶血剂继续作用的效果。另溶血后染色/染色后溶血效果各有不同。有些样本可能存在某些特殊问题血小板可能会与CD34+或CD34-细胞结合影响精确计数这个问题可通过增加EDTA来解决聚集的血小板可能会与CD34CD45抗体微弱结合但可通过巧妙的设门方案将其去除样本保存：血小板聚集问题，细胞死亡问题，冻存液如DMSO对样本的影响抗体选择：荧光素对抗体结合的影响阴性对照：在用CD34抗体染色的标本中目标细胞群可能少于总细胞群的0.1%而只有目标细胞群大于1%时才合适用同型作为阴性对照。需使用多参数设门来确定阴性对照收集标本数：由于CD34+细胞一般只占1%整单个核细胞固可将其视作泊松分布曲线如要得到一个变异系数为10%左右值就要采集100个阳性细胞。第67页/共99页第一步一个门R1是基于CD45/SSC双参数图上的通过对其设门可去除红细胞碎片和聚集物这些干扰在造血细胞样本中尤为多见特别是在样本使用溶血-免洗法处理后第68页/共99页第二步将通过R1门获取的细胞显示在CD34/SSC双参数点图在此图中设立R2门并调节其位置包含所有CD34强阳性或弱阳性的并SSC信号弱及中等的细胞第69页/共99页第三步建立一CD45/SSC双参数点图将以上CD34阳性细胞显示于其中在其中设门R3门去除CD34阳性颗粒中的聚集血小板淋巴细胞和单核细胞第70页/共99页第四步将R3门中圈定的细胞显示在FS/SS图中以检测细胞是否落在平时的幼稚淋巴细胞门R4中通过R4要去除比淋巴细胞小的颗粒第71页/共99页第五步如何确定R4门的位置呢？方法如下在CD45/SSC双参数点图中设立R5门圈定CD45强阳性且SSC低信号的淋巴细胞群体将R5门中的细胞显示在R4门所在的FS/SS双参数直方图中根据其中的淋巴细胞的位置调节R4门确定R4门在FS和SS轴上最小值的最低范围第72页/共99页第六步R1门在CD45从标的下限则根据以下直方图来确认建立第5张CD45/CD34双参数直方图根据CD34阳性颗粒的CD45表达的最小值建立十字门确保所有CD34阳性CD45极弱表达的细胞全部在CD45设定界线的左侧然后根据此进的CD45界线位置确定R1门的最小值第73页/共99页第七步绝对计数：对于普通流式细胞仪在样本中加入标准微球，校准流式细胞的计数，从而得出干细胞的浓度Partec流式细胞仪所有检测指标均为绝对计数，无需校准微球，计数过程由硬件完成。第74页/共99页阴性对照对于阳性细胞数很少的样本，如何建立有效的阴性对照是值得考虑的问题第75页/共99页流式细胞仪数据保存及分析所有商业流式细胞仪样本分析结果数据包均以FCSII格式保存无论操作平台是DOS、Windows、MAC，流式数据文件均可被自由拷贝流式数据包含有各项参数信息及分析颗粒信号信息第76页/共99页功能强大的免费分析软件：PC版WinMDI提供流式软件分析所需的所有功能，运行在Windows平台可在任何PC机上分析流式数据并输出报告下载：第77页/共99页临床流式细胞仪应用简介以下将简单地、举例性地介绍流式细胞可开展的部分项目。只须掌握了流式细胞仪的原理及操作软件，您可开展任何基于荧光技术的检测项目流式细胞仪是一种任您自由展开想像力的、非凡的检测工具第78页/共99页DNA倍体分析：DNA分析是流式细胞仪最初且是现在应用最广检测项目。由于恶性细胞DNA含量通常与正常细胞不同，存在异倍体细胞，所以现有很研究评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系。DNA含量检测还可提供细胞周期方面的信息，这在细胞生物学中运用很广泛。特别地，它可表示出细胞毒性药物对细胞作用过程。这些DNA检测还可与细胞表面标志物标记同时进行，这样在细胞混合培养中，可通常追踪表达特异标志物的细胞显示其生长周期情况。所有方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反应并发射出荧光，常用的染料为PI，DAPI。流式细胞仪要求：488nm光源，575nm滤光片。第79页/共99页乳腺癌DNA异倍体患者生存率DNA倍体分析中，S期的含量也是评估疾病预后的重要指标第80页/共99页DNA倍体的诊断标准1.发现DNA非整倍体细胞峰诊为癌2.如无明显的非整倍体细胞峰便有一个突出的四倍体细胞峰和大于15%的超二倍体细胞S期细胞并伴G0/1峰的CV值大于9%诊为癌3.无明显的非整倍体细胞峰但G0/1峰CV值增大并伴有大于10-15%超二倍体细胞和一个突出的四倍体峰位诊为可疑癌检测是结合肿瘤标记物，特异性地分析肿瘤细胞的DNA含量有助于提高诊断的准确率。第81页/共99页细胞生存能力实验，使用Heochest33342染料与DNA特异性结合，后因细胞活力不同染料的结合程度也各异，故可评估细胞的活性度。流式细胞仪要求：360nm光源，455nm滤光片计数外周血中检测网织红细胞：使用TO染料能够特异性地与RNA结合，结合系数高达3000，故具有很好的信噪比。流式细胞仪要求：488nm光源，525nm滤光片，液量绝对计数系统第82页/共99页网织红细检测网织红细胞数量可作为贫血及治疗效果的监测。RBCsReticulocytesPlateletsNucleatedCellsIRF第83页/共99页PlateletAssociatedIg

PAIg血小板自身抗体检测血小板自身抗体检测：血小板自身抗体识别人血小板抗原，会引起各种临床相关症状，如新生儿自免性血小板减少症、输血后紫癜、难治性血小板减少。流式细胞可快速准确地检测血小板自身抗体。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别血小板抗体。仪器要求：488nm光源，525nm、575nm滤光片与网织血小板同时检测可时，两者均为阳性时提示为自身免疫性贫血第84页/共99页移植交叉配型：原细胞毒实验，主要用于避免移植物超急性排拆反应。流式细胞仪用于监测T或B细胞是否受到受体血清中免疫球蛋白攻击，作为HLA配型前的预实验。流式细胞仪因其高精确性已成为该领域内的金标准。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别T细胞CD3或B细胞CD29抗体。仪器要求：488nm光源，525nm、575nm滤光片第85页/共99页细胞毒实验第86页/共99页检测细胞经抗原或细胞有丝分裂刺激后活化效应：淋巴细胞早期活化指标CD69可用来检测免疫治疗效果。流式细胞使用三色分析可监测淋巴细胞各亚群活化情况：FITC标记的CD3抗体、PE标记的CD8抗体、PE-CY5标记的CD69抗体。仪器要求：488nm光源，525nm、575nm、575nm滤光片细胞增殖状态检测：核增殖抗PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量细胞增殖分裂状况，在评估肿瘤预后有重要意义。为些标志物的检测一般同细胞表面标志物同时检测。FITC标记PCNA或Ki67或BrdUrd，PE或（并）PE-CY5标记细胞表面标志物。仪器要求：488nm或633nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片第87页/共99页检测细胞内因子（TH1/TH2细胞检测）：未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少用流式细胞仪很难检测出来因此在检测前需刺激活化活化所用的刺激素为PMA佛波酯+Ionomycin淋巴细胞在刺激素的作用下活化分泌细胞因子到细胞外因流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测如细胞因子分泌到细胞外则检测不到因此必须阻止细胞因子的分泌抑制细胞因子分泌的试剂为BrefedlinA或Monensin。Th1/Th2细胞首先是CD4+T细胞因此存在着用CD4来设定细胞群的问题我们知道CD4不但在T细胞上表达还在所有的单核细胞上表达因此单独用CD4设门无法将CD4+T细胞区分开来那么我们用CD3和CD4双参数设门是否可以呢回答是否定的因为在佛波酯的刺激作用下CD4抗原的表达会迅速下调甚至完全丧失所以不适合于设门用CD3和CD8设门因CD8不受佛波脂的影响且绝大多数D3+CD8-的细胞都是CD3+CD4+细胞因此可用CD3+CD8-细胞群来确定CD4+T细胞群。FITC标记CD8，PE标记IL-4和，PE-CY5标记IFN-r，APC或PE-CY7标记CD3。

仪器要求：488nm或633nm（仅限APC染料）光源，525nm、575nm、675nm，767nm滤光片第88页/共99页染色体分析：流式细胞仪染色分析运用两种特异性染料：Hoechest33258与核苷酸AT结合；ChromomycinA3与GC相结合。从而在双参数坐标上根据染色体ATCG含量的不同识别各种染色体。平时进行的染色体分析耗时且需要操作者极具经验，而用流式细胞仪时可快速地识别出异常染色体，如加配分选系统可将这些异常染色体分选出来作进一步分析。仪器要求：360nm或488nm光源，450nm、580nm滤光片BrdUrd标记追踪细胞分化：通过细胞分化时涉入溴化尿嘧啶，再使用抗BrdUrd抗体及PI核酸染料可精确识别它们。在流式细胞仪上可清楚地识别出处于G1、S、G2、M期的细胞，在肿瘤研究中有着重要作用。仪器要求：488nm光源，525nm、575nm滤光片第89页/共99页淋巴细胞亚群分析：外周血CD3、CD4、CD8、CD19、NK等各类淋巴细胞亚群定量分析。仪器要求：488nm光源，525nm、575nm滤光片，液量绝对计数系统

白血病免疫分型：CD45设门三色白血病免疫分型。仪器要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。最少三色荧光，参数越多检测越为灵敏。

血小板分析：血小板活化实验、血小板功能分析。血小板识别抗体及相应活化指标。仪器要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片，液量绝对计数系统第90页/共99页血小板分析：血小板活化实验、血小板功能分析。血小板识别抗体及相应活化指标。仪器要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片，液量绝对计数系统白血病、淋巴瘤微小残留病灶检测：根据初诊免疫分型结果，多参数联合设门检测是否有残留白血病细胞，监测白血病的复发。T系白血病微小残留病灶检测仪器要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片，液量绝对计数系统B系白血病微小残留病灶检测，液量绝对计数系统仪器要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。最少三色荧光，参数越多检测越为灵敏。髓系白血病微小残留病灶检测，液量绝对计数系统仪器要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。最少三色荧光，参数越多检测越为灵敏。第91页/共99页血小板活化实验要求减少血小板聚集聚集血小板在流式细胞仪可被检测出来但是如果血小板发生了聚集流式细胞仪便不能检测聚集血小板中每个血小板所表达的抗原数量了这是因为流式只检测每个颗粒的表达荧光而无法区分这个颗粒单个血小板还是由一定数量血小板聚积而成在准备全血标本时可依据以下标本处理方法使血小板聚集现象减到最低对于每个样本都要监测血小板的聚集情况聚集血小板往往会出现在FS和SS坐标中右上象限内减少全血标本中血小板聚集的标本处理方法•在抽血前准备好所有在标本处理过程中所需试剂以避免延误时间•

抽血时针管不要细于21号•

平稳放松地抽取血液•

弃用前2ml血液•

使用聚乙稀试管或针筒•

立即与抗凝剂混匀•

不要进行洗涤离心过滤晃动等巨烈的处理步骤•

加入缓冲液稀释血小板浓度•

如果要使用凝血酶作为激活剂则在其中要加入肽GPRP第92页/共99页固定检测血小板活化都需要限制血小板自身的或被激活的体外活化通过抗激活药物肌苷潘生丁或固定方法通常使用多聚甲醛都可限制血小板自发或被动活化固定或许会破化某抗原与单抗结合的位点如用福尔马林固定标体还会引起血小板的自发荧光所以在检测中选用恰当的阴性对照此外固定的标本中不应存在未结合的抗体这会引起非特异性结合建议先将标本与抗体孵育洗去未结合抗体后固定然而这会在处理过程引起额外的血小板活化并且这很难控制对血小板进行固定对于临床不能立即上流检测的标本来说是极为有利的方法固定可以减少血小板在体外的人为活化对于绝大多数抗体来说使用染色后再固定的方法进行处理的标本立即上机检测与在24小时内分析在荧光强度上没有明显差异并且固定前染色方法并立即上机检测与固定后24小时内染色分析在荧光强度上也没有明显差异然而要注意因固定方法而对标本引起的变化特别是使用固定前染色的单抗时因为对于检测血小板活化依赖性单抗与固定后的血小板结合率会有下降此外有些单抗与固定后的血小板结合率会表现出时间相关性减少所以每个实验室在使用种新抗体时必须选择最恰当的固定方法第93页/共99页细胞凋亡分析：DNA凋亡峰检测、ANNEXIN-V/PI双染法凋亡检测。仪器要求：488nm光源，525nm、575nm滤光片 肿瘤耐药分析：P-gp、LRP、MRP、BCRP各类耐药蛋白表达及功能检测。仪器要求：488nm光源，525nm、575nm、