生化反应工程实验

生化反应工程实验第1页/共20页一．实验目的1.掌握细胞反应动力学的研究方法；2.巩固还原糖和生物量的测定原理与方法；3.掌握酶反应速度的实验测定方法；4.掌握最大反应速度rmax和米氏常数Km的测定方法。第2页/共20页二．实验原理对细胞反应：实验可得不同t的底物浓度Cs值和Cx值(细胞浓度)。要求动力学参数KS，μmax；必求μ，——测定时间区间△t内细胞浓度平均值。第3页/共20页碱性磷酸酶碱性条件下，催化磷酸单酯水解。根据酶催化反应机理：可推导出米氏方程：通过测定不同底物浓度CS下的反应速度r，可确定rmax和Km。在510nm波长处比色测定OD值，从而计算出酶的活性（反应速度r）。

ONa│O－P==O││ONa

OH│+Na2HPO4

+H2O

碱性磷酸酶一定pH、T催化反应：醌类化合物（红色）

OH│+AAP铁氰化钾OH－第4页/共20页三．菌种、培养基、实验试剂和主要仪器1．枯草芽孢杆菌AS1.3982．Tris-培养基：葡萄糖0.4%；NaCl0.5%；（NH4）2SO41%；KCl0.1%；CaCl20.1mmol/L；MgCl21mmol/L；Na2HPO420μmol/L；酪蛋白水解物0.1%，溶于0.1mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.4）中。分装于150ml三角瓶中，每瓶装50ml，于115℃，灭菌30min，冷却。（周二下午做)3．0.1mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.4）4．0.1mol/LpH8.8Tris-醋酸缓冲液5．40mmol/L底物溶液6．0.5mol/L氢氧化钠溶液7．0.3%（W/V）4-氨基安替比林（AAP）溶液8．0.5%（W/V）铁氰化钾溶液9．3,5－二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)10．1mg/ml葡萄糖标准液11.甲苯12．移液管，刻度试管，容量瓶，滤纸，三角瓶，布式漏斗，电子天平，恒温水浴槽，摇床，干燥箱，721分光光度计，灭菌锅，冰箱。第5页/共20页四．实验方法与步骤1.种子液制备（以班为单位）

枯草杆菌在固体斜面培养基上活化后。接入8个装有50mlTris-培养基的150ml三角瓶中，于30℃振荡培养18h作为种子液。（周三下午2:30做)

2.发酵液制备（以组为单位）将上述培养好的种子液接入10个装有50mlTris-培养基的150ml三角瓶中，接种量5％（v：v），于37℃振荡培养0h、1h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h(发酵到上述每一定时间取一瓶，测定发酵液的残糖含量和生物量，测定原理与方法见附录一，二)。培养时间（hr）0122.533.544.555.5生物量mg/ml残糖mg/ml表1发酵动力学实验数据第6页/共20页3．枯草杆菌碱性磷酸酶酶液的制备

取种子液2瓶，分别加入甲苯（甲苯与种子液体积比1：20）（加一滴甲苯/1ml培养液），摇匀，37℃保温30min，制成酶液备用。第7页/共20页酶促反应动力学的研究试剂（ml）102030405060空白底物溶液0.10.20.30.40.81.0—pH8.8Tris缓冲液1.01.01.01.01.01.01.0蒸馏水0.90.80.70.60.2—1.0NaOH溶液1.01.01.01.01.01.01.00.3%AAP溶液1.01.01.01.01.01.01.0铁氰化钾溶液2.02.02.02.02.02.02.0充分混匀，放置10minA510nm反应前：反应后：试剂（ml）123456底物溶液0.10.20.30.40.81.0pH8.8Tris缓冲液0.60.60.60.60.60.6蒸馏水0.90.80.70.60.2—37℃水浴保温5min酶液0.40.40.40.40.40.4充分摇匀，37℃准确保温15minNaOH溶液1.01.01.01.01.01.00.3%AAP溶液1.01.01.01.01.01.0铁氰化钾溶液2.02.02.02.02.02.0充分混匀，放置10minA510nm

酶活力（单位）=△OD510×1000=（OD510反应后－OD510反应前）×1000r即为酶活力。底物浓度对酶反应速度的影响——rmax和Km的测定

取13支试管，编号，按下表准确操作。以空白管调零点，在510nm波长处比色测定A510nm。第8页/共20页五．实验结果1.发酵动力学确定发酵实验数据处理做确定μmax与Ks。进而确定发酵动力学。4.5～5.085.0～5.594.0～4.573.5～4.063.0～3.552.5～3.042.0～2.531.0～2.020.0～1.01△t序号△

第9页/共20页2.底物浓度对酶反应速度的影响——rmax和Km的测定CSr1/CS1/r酶反应实验数据处理在坐标纸上做1/r～1/CS图，由此求Km和rmax值。第10页/共20页3,5－二硝基水杨酸比色法(DNS法)测定还原糖附录一第11页/共20页△一．原理

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线便可求出还原糖的量。二．试剂1.3,5－二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)2.1mg/ml葡萄糖标准液第12页/共20页取7支25ml刻度试管，编号，按下表操作。二.制作标准曲线管号空白123456葡萄糖标准液（ml）00.20.40.60.81.01.2蒸馏水（ml）2.01.81.61.41.21.00.8DNS试剂(ml)1.51.51.51.51.51.51.5加热摇匀，在沸水浴中加热5分钟冷却立即用流动冷水冷却蒸馏水（ml）6.56.56.56.56.56.56.5光密度(O.D.540nm)

将上述各管溶液混匀后，在540nm波长下，用空白管溶液调零，测定吸光度值。以光密度值为横坐标，以葡萄糖毫克数为纵坐标，绘制标准曲线。第13页/共20页

取10支试管为例，按表操作。将各管混匀后，测定各管的光密度。用制作标准曲线中的空白管溶液调零。三.测糖

残糖浓度(mg/ml)=还原糖毫克数/0.3样品12345678910发酵液(ml)0.30.30.30.30.30.30.30.30.30.3蒸馏水(ml)1.71.71.71.71.71.71.71.71.71.7DNS试剂(ml)1.51.51.51.51.51.51.51.51.51.5加热混匀，在沸水浴中加热5分钟冷却立即用流动冷水冷却蒸馏水(ml)6.56.56.56.56.56.56.56.56.56.5OD值(540nm)

在标准曲线上查出相应的还原糖含量，按下述公式计算出发酵液残糖浓度。第14页/共20页菌体量(CX)的测定：附录二

生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。本实验两组采用比浊法，两组采用直接称重法。第15页/共20页

比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与光密度成正比，所以可用比色计测定菌液的光密度(OD值)表示样品菌液浓度。具体操作：将培养0h、1h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h的菌悬液摇匀后，于560nm波长下，测定0D值作为CX。用未接种的培养基作空白对照。

1.比浊法第16页/共20页

此法分为湿重法和干重法。干重法系单位体积培养物经过滤（或离心）后，在105℃烘箱中烘干至恒重（1～1.5hr），冷却至室温称重。具体操作：先称取干燥的滤纸重量，记为W1（g），取发酵液过滤，上清液保存于冰箱进行糖浓度测定，菌体和滤纸一起于105℃