生化实验实验四聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清

生化实验实验四聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清第1页/共27页聚丙烯酰胺凝胶电泳分离LDH第2页/共27页【实验原理】电泳概述及原理聚丙烯酰胺凝胶电泳原理乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色原理第3页/共27页一、概述1、电泳概念：带电粒子在电场中向着与其本身电荷相反的电极移动的过程。2、电泳技术优点：快速、准确、重现性好3、电泳方法分类4、电泳条件：水溶液（缓冲液）、支持物（区带电泳）、电场（电泳仪、电泳槽）电泳概述及原理第4页/共27页二、电泳的基本原理迁移率：带电颗粒在单位电场强度下的移动速度。

m＝v/E=(d/t)/(V/L)=(dL)/Vt影响电泳的因素：1、颗粒本身：带电量、大小、形状2、外界因素：电场强度E、pH、离子强度I、电渗、缓冲液粘度及温度等。第5页/共27页1、带电颗粒的物理性状包括带电颗粒电荷数，颗粒大小、形状和空间构型。Q↑，v↑；r↑，v↓。第6页/共27页2．支持物介质支持物的多孔结构——电渗作用多孔支持物表面可吸附电极溶液中的正离子或负离子使靠近支持物的溶液层相对带电，在电场作用下，溶液就会向一定方向移动。凝胶支持物结构的孔隙对带电颗粒分子产生阻力。第7页/共27页

3．缓冲溶液：①pH值：溶液的pH值决定带电颗粒的解离程度，亦即决定Q。②离子强度：一般最适的离子强度在0.02～0.2之间，溶液的离子强度越高，则电泳速度越慢。③溶液粘度：迁移率与溶液粘度呈反比关系。第8页/共27页4．电场强度（E）：电场强度是电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯度。

E↑，v↑第9页/共27页聚丙烯酰胺凝胶的性能聚丙烯酰胺凝胶的制备聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理【聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）】第10页/共27页一、聚丙烯酰胺凝胶的性能特性：机械强度好，有弹性，透明，相对化学稳定，对pH和温度变化较稳定，没有吸附和电渗作用。调节单体的浓度和交联度可以控制孔径大小。聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，能分离、小量制备生物大分子，而且可用来研究生物大分子的性质如电荷、相对分子质量、等电点以及构象等。第11页/共27页丙烯酰胺（Acr，单体）＋N,N-甲叉双丙稀酰胺（Bis，交联剂）→（催化剂）→聚合催化剂：（1）过硫酸铵＋四甲基乙二胺（TEMED）（2）核黄素（VitB2）＋光根据要分离物质的相对分子质量选择合适的单体浓度。二、聚丙烯酰胺凝胶的制备第12页/共27页第13页/共27页

【凝胶总浓度及交联度对凝胶的影响】

凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚丙烯酰胺凝胶特性包括其机械性能、弹性、透明度、粘着度及孔径大小的主要因素。T为凝胶总浓度，C为交联度。

a为丙烯酰胺单体的质量(g)，b为交联剂的质量(g)，m为溶液的终体积(mL)。凝胶a、b的比例决定了凝胶的物理性状。当a:b小于10时，凝胶脆且硬，不透明，呈乳白色；当a:b大于100时，即使用5%的丙烯酰胺凝胶也呈糊状；通常用a:b在30左右，并且丙烯酰胺浓度高于3%，凝胶富有弹性并且透明。第14页/共27页

三、聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理四个不连续性：凝胶浓度的不连续性；缓冲液离子成分的不连续性；缓冲液pH梯度的不连续性；电位梯度的不连续性。三个效应：浓缩效应、分子筛效应与电荷效应第15页/共27页

1.浓缩效应1）凝胶层的不连续性

两层凝胶T与C不同孔径不同

浓缩胶：大孔径分离胶：小孔径

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2）缓冲液离子成分的不连续性甘氨酸

（pI=6.0）在pH8.3带负电，朝正极移动，进入浓缩胶（pH6.7），甘氨酸解离度（）很小，有效迁移率（M）很低，移动速度较慢，称为慢离子。HCl

强电解质，=1，Cl-有效迁移率大，移动速度快，称快离子。蛋白质（pI＜6.0）带负电荷，有效迁移率介于两者之间。

第17页/共27页pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液

甘氨酸Cl-蛋白质样品胶浓缩胶分离胶样品低电导区第18页/共27页

3）pH值的不连续性

为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率，必须使浓缩胶与分离胶之间pH值有所区别。第19页/共27页

2.分子筛效应与电荷效应

进入分离胶后，Gly-成为快离子分离胶只有电荷效应和分子筛效应，根据各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而分离第20页/共27页

1959年Markert等用电泳的方法将纯化的心肌乳酸脱氢酶(LDH)分离出5条区带，由阳极到阴极依次命名为LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5。

【LDH聚丙烯酰胺凝胶电泳】第21页/共27页【乳酸脱氢酶同工酶染色】将凝胶浸泡在活性染色液中，LDH与底物的反应第22页/共27页LDH4LDH3LDH5LDH1LDH21234【电泳结果实例】第23页/共27页电泳装置

采用Pharmacia公司的SE250小型夹心式垂直板电泳装置：

制胶装置制备凝胶板

电泳装置进行凝胶电泳第24页/共27页【凝胶电泳的操作要点】

1、凝胶制备

2、电极缓冲液

3、样品处理及加样

4、电泳

5、染色第25页/共27页试剂分离胶浓缩胶A液(ml)1.8B液(ml)2.0C