生物化学-蛋白质

生物化学-蛋白质第1页/共127页一、氨基酸分子中含有氨基的羧酸均称为氨基酸。作为蛋白质结构单元的氨基酸均为L--氨基酸。天然蛋白质由20种基本氨基酸组成，有少数蛋白质还含有若干种不常见的氨基酸，它们都是基本氨基酸的衍生物。

第一节 蛋白质的结构组成

第2页/共127页1，氨基酸的结构和分类

从蛋白质水解产物中分离得到的基本氨基酸中，除不含手性碳原子的甘氨酸和含有环状二级氨基的脯氨酸外，其他均具有如下结构通式。

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脂肪族氨基酸

含羟基、含硫氨基酸、环氨基酸

第4页/共127页

芳香族氨基酸、碱性氨基酸

酸性氨基酸及其酰胺第5页/共127页2，几种重要的不常见氨基酸在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。其中重要的不常见蛋白质氨基酸的结构如下。第6页/共127页3，非蛋白氨基酸

除了上述构成蛋白质的氨基酸以外，自然界还存在一些并不是蛋白质组分的氨基酸，这些氨基酸通常被称为非蛋白氨基酸，至今已经发现200多种以上，它们具有不同的功能。

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某些非蛋白氨基酸的结构与功能

-丙氨酸：泛酸及辅酶A的组成成分-氨基丁酸：存在与脑组织中的神经递质高半胱氨酸：甲硫氨酸生物合成的中间产物高丝氨酸：氨基酸代谢的中间产物鸟氨酸：尿素生成过程的中间产物瓜氨酸：苯甘氨酸：抗菌素构成成分(MicakgcinB)第8页/共127页二、氨基酸的性质除甘氨酸外，氨基酸均含有一个手性-碳原子，因此都具有旋光性。比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据1，氨基酸的旋光性第9页/共127页2，氨基酸的光吸收构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(<220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。酪氨酸的max＝275nm，275=1.4x103;苯丙氨酸的max＝257nm，257=2.0x102;色氨酸的max＝280nm，280=5.6x103;第10页/共127页3，氨基酸的离解性质氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化。PH1710净电荷+10-1

正离子两性离子负离子

等电点PI第11页/共127页甘氨酸的酸碱滴定曲线第12页/共127页4，氨基酸的等电点

当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK’1和pK’2的算术平均值：pI=(pK’1+pK’2)/2

同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK’值的算术平均值。酸性氨基酸：pI=(pK’1+pK’R-COO-

)/2

硷性氨基酸：pI=(pK’2+pK’R-NH2)/2第13页/共127页第二节多肽一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。一、多肽的结构由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。第14页/共127页多肽的形成与结构

第15页/共127页在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：

Ser-Val-Tyr-Asp-Gln第16页/共127页二、肽键肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。组成肽键的原子处于同一平面。第17页/共127页肽键肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。第18页/共127页四肽的结构第19页/共127页三、多肽的性质

多肽分子中含有游离的末端氨基和羧基，氨基酸残基的侧链上也含有可离解基团，因此，多肽可以看成是一个“大氨基酸”。多肽在水溶液中也以两性离子的形式存在，有等电点。在等电点时，正离子数目与负离子数目相等，净电荷为零。等电点的高低，主要取决于侧链上的碱性和酸性基团的相对数目。

1，多肽的两性离解

第20页/共127页2，多肽链的水解

多肽的肽键与一般的酰胺键一样，可以被酸或碱水解，也可以被酶水解。根据多肽水解程度的不同可以分为完全水解和部分水解。完全水解得到各种氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片段。酸或碱能够将多肽完全水解，酶水解一般是部分水解。

第21页/共127页（1）酸水解常用6mol/L的盐酸或4mol/L的硫酸在105-110℃条件下进行水解，反应时间约20小时。此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏；含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。第22页/共127页（2）碱水解一般用5mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。部分的水解产物发生消旋化。该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。第23页/共127页（3）酶水解目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteolyticenzyme）或称蛋白酶（proteinase）已有十多种。应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。第24页/共127页

四、天然存在的重要多肽在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。第25页/共127页第26页/共127页Met-脑啡肽Leu-脑啡肽牛催产素（九肽）

短杆菌肽S(环十肽)

第27页/共127页谷胱甘肽-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸，简写为GSH，是广泛存在于动物和植物细胞中的一种三肽，在生物体内发生的氧化还原反应中起重要作用。它有两种存在形式，即还原型和氧化型：

第28页/共127页第三节

蛋白质的结构蛋白质是由一条或多条多肽链以特殊方式结合而成的生物大分子。蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大,从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。第29页/共127页蛋白质结构层次的界定

蛋白质结构非常复杂，1969年国际纯化学与应用化学联合会（IUPAC）对蛋白质高级结构的不同层次作了界定主要包括以肽链线性结构为基础的一级结构，以及由肽链卷曲、折叠而形成的三维结构-蛋白质的二级、三级和四级结构。

第30页/共127页第31页/共127页一、蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构(Primarystructure)包括组成蛋白质的多肽链数目.多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。牛胰核糖核酸酶的一级结构

第32页/共127页蛋白质一级结构的测定蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。胰岛素是由动物胰岛分泌出来的一种蛋白质激素。第33页/共127页蛋白质一级结构的测定的步骤

（1）测定蛋白质氨基酸残基组成，根据蛋白质分子量，计算出构成蛋白质的各种氨基酸的数量。（2）测定蛋白质分子中多肽链的数目。（3）二硫键的断裂及多肽链的拆分。（4）多肽链的选择性降解及肽段的氨基酸组成和顺序的测定。（5）利用酶选择性降解和溴化氰选择性降解得到的各肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序，并确定多肽链中二硫键的位置。第34页/共127页第35页/共127页二、蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构是指肽链的主链在空间的排列。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。肽链主链的构象是由肽键的特殊结构决定的。组成肽键的原子都处于同一平面。在肽链中，两个相邻的肽键通过一个共同的-碳原子相连接。由于C-N和C-C键可以自由旋转，因此，在保持肽键平面结构不变的条件下，能够形成不同的空间排列。

第36页/共127页二面角（ф，ψ）一个肽平面围绕N1-C旋转的角度用ф表示；另一个肽平面围绕C-C2旋转的角度，用ψ表示。这两个旋转角度叫二面角。一对二面角（ф，ψ）决定了与一个-碳原子相连的两个肽平面的相对位置

第37页/共127页肽平面的几种不同的构象类型

第38页/共127页蛋白质二级结构的类型维持主链空间排列的另一个重要因素是氢键。主链中的-C=O和-N-H能够相互形成链内或链间的氢键。在各种可能的构象中，能够形成氢键最多的构象最稳定。蛋白质二级结构主要有-螺旋、-折叠、-转角和无规则卷曲。

第39页/共127页多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离为0.15nm;肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的酰胺基团的-CO基与第四个氨基酸残基酰胺基团的-NH基形成氢键。蛋白质分子为右手-螺旋。（1）-螺旋第40页/共127页肽链-螺旋结构的四种表示方法

第41页/共127页-螺旋第42页/共127页（2）-折叠-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿桩折叠构象在-折叠中，-碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm；

-pleatedsheet第43页/共127页蛋白质的-折叠结构

第44页/共127页-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。-折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。（2）-折叠第45页/共127页蛋白质-折叠结构的顺反形式

第46页/共127页（3）-转角-turn在-转角部分，由四个氨基酸残基组成;弯曲处的第一个氨基酸残基的-C=O和第四个残基的–N-H之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。这类结构主要存在于球状蛋白分子中。第47页/共127页蛋白质的两种主要-转角结构

由于甘氨酸和脯氨酸结构的特殊性，常常出现在-转角结构中。

a：I(普通转角)；b：II(甘氨酸转角)

第48页/共127页（4）无规则卷曲

指没有明确规律性的肽链构象，但仍然是紧密有序的稳定结构，可以通过主链间氢键，甚至在主链与侧链间形成氢键而维持其构象。无规则卷曲的类型大体上可以分为两大类。

第49页/共127页①紧密环（compactloop）

肽链片段的主体结构形成一端开放的环状，其主链卷曲成希腊字母，所以又称环。此肽链片段由616个氨基酸残基组成，其残基侧链可堆积在环内，通过疏水作用或形成氢键等成为紧密结构，肽链片段两末端间距离较小，从第一个C到最后一个C之间为0.371.0nm。环可能与蛋白质的识别功能有关，并参与催化作用。

第50页/共127页②连接条带

伸展的肽链条带构成二级结构单元之间的连接，有以下几种类型：①S型的-连接；②长度和构象不一的-和-连接；③弓连接了不相邻的链，形成希腊花边连接。

第51页/共127页三、蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构(TertiaryStructure)是指在二级结构基础上，肽链的不同区段的侧链基团相互作用在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。维系这种特定结构的力主要有氢键、疏水键、离子键和范德华力等。尤其是疏水键，在蛋白质三级结构中起着重要作用。第52页/共127页1，超二级结构在某些具有特殊功能的球状蛋白质分子中，常常出现许多相邻的二级结构单元按照一定规律、规则地组合在一起，彼此相互作用，形成在空间构象上有区别的二级结构组合单位，称为超二级结构。它可以作为构成三级结构的元件。超二级结构有（两个-螺旋互相缠绕构成）、（两个-折叠通过一段肽链连接）、（三段-折叠链和两段-螺旋组成）和（三条反平-折叠通过-转角连接）等几种类型。第53页/共127页

蛋白质中的几种超二级结构

第54页/共127页结构域（structuraldomain）对于一些相当大的蛋白质分子，一条长的多肽链，有时要先分别折叠成几个相对独立的区域，再组装成球状或颗粒状的复杂构象（三级结构）。这种在二级结构或超二级结构基础上形成的特定区域称为结构域（structuraldomain）。每个结构域自身都是紧密装配的，但结构域之间的联系是比较松散的，因此在两个结构域间常常形成空穴。不同的蛋白质，其结构域的数目各不相同。蛋白质分子分成几个结构域的现象，通常与蛋白质的功能有关。第55页/共127页2，三级结构的折叠类型

以结构域为单位，根据二级结构的类型、数量、组合方式等，三级结构主要有以下几种类型。

第56页/共127页（1）全类型

蛋白质结构中的二级结构以-螺旋为主，各段-螺旋通过反平行或近于相互垂直的状态连接，排列成层，再平行叠起，从而形成三级结构的构象基础。全类型有升降螺旋捆和希腊花边螺旋捆等几个亚型。升降螺旋捆由各邻近的-螺旋头尾相连，反向排列成桶状，常为四螺旋捆。第57页/共127页蛋白质的全类型三级结构

蚯蚓肌红蛋白烟草花叶病毒外壳蛋白

血红蛋白亚基

第58页/共127页（2）平行/类型

整个肽链中-螺旋与-折叠交替存在，卷曲组成多层，一般平行的-折叠片层在结构域的内部，-螺旋覆盖在外部，实际上是超二级结构的进一步连接扩充，大多数卷曲成右手交叉连接。

丙酮酸激酶

己糖激酶第59页/共127页（3）反平行类型

主要由-折叠片层反平行排列形成，链之间以-转角连接，或者以跳过相邻链的条带而进行连接。常见的希腊花边桶的链呈反时针方向盘绕，桶的相对两边链呈右手交叉连接

前血清白蛋白免疫球蛋白第60页/共127页（4）不规则结构类型

许多小蛋白质立体结构不规则，其中正规的二级结构单元较少，没有上述几种结构类型。有些蛋白质富含金属元素，有些富含二硫键。

第61页/共127页3，多结构域蛋白质

大分子的蛋白质往往具有多个结构域，其三级结构是在结构域构象的基础上通过肽链连接形成的。第62页/共127页四、蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构(QuaternaryStructure)是指由多条各自具有一、二、三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式；各个亚基在这些蛋白质中的空间排列方式及亚基之间的相互作用关系。蛋白质的四级结构主要涉及具有三级结构的多肽链聚合形成蛋白质时的空间排列方式和相互作用。许多天然球状蛋白质多是由两条或多条肽链构成的，在这些蛋白质分子中，肽链之间没有共价键连接，每条肽链各自具有一、二、三级结构。

第63页/共127页1，寡聚蛋白的亚基数目

这种蛋白质分子中，最小的单位通常称为亚基或亚单位（Subunit），它一般由一条肽链构成，无生理活性；维持亚基之间的化学键主要是疏水力。由多个亚基聚集而成的蛋白质常常称为寡聚蛋白。

蛋白质亚基数目醇脱氢酶2苹果酸脱氢酶2醛缩酶33-磷酸甘油醛脱氢酶4乳酸脱氢酶4血红蛋白4谷氨酸合成酶12蕃茄株低矮病毒外壳蛋白180第64页/共127页2，寡聚蛋白亚基的排列方式第65页/共127页两个亚基的结构第66页/共127页第四节化学物质与蛋白质的相互作用

在生物体内，蛋白质（包括酶）占细胞干重的70%以上，种类繁多，在生命活动过程中起着发挥各种各样的作用。随着人们对环境保护和生活质量要求的提高，蛋白质在食品、医药（生化药物、临床检验、药物筛选等）、环保（环境分析）、农业、日用化工（化妆品）、精细化工（酶催化合成）等领域的应用日益广泛。在蛋白质体外的应用中，一般涉及到分离纯化、储存、含量检测等过程，其中常常发生化学物质与蛋白质非专一性的相互作用，如沉淀作用、变性作用、稳定作用以及化学修饰作用等。

第67页/共127页一、化学物质对蛋白质的沉淀作用

由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。根据蛋白质的亲水胶体性质，当其环境发生改变时，蛋白质会发生沉淀作用。蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质。在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。

第68页/共127页沉淀作用的类型可逆沉淀不可逆沉淀抗体-抗原沉淀在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。蛋白质在沉淀过程中结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，又称为非变性沉淀。在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，又称为变性沉淀。抗体和抗原蛋白通过相互识别和结合而发生的沉淀现象。这种特殊的沉淀作用是生物体免疫功能的基础。第69页/共127页沉淀剂的类型无机物沉淀等电点沉淀有机物沉淀聚合物沉淀盐析

最常用的盐析剂是硫酸铵、硫酸钠磷酸钾磷酸钠金属离子

应用较广的是Zn2+，Ca2+，Mg2+，Ba2+，Mn2+在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。主要缺点是酸化时易使蛋白质失活，有机溶剂水互溶的有机溶剂使蛋白质沉淀。20-50%乙醇，丙酮有机物包括鞣酸苦味酸（即2,4,6-三硝基苯酚）、三氯乙酸、磺基水杨酸等。非离子型聚乙二醇等能降低水化度，使蛋白质沉淀常用的是6000聚电解质如羧甲基纤维素，海藻酸盐聚丙烯酸，聚乙烯亚胺等。第70页/共127页二、化学物质对蛋白质的稳定作用

许多蛋白质在一般缓冲溶液中的稳定性相当低，某些酶蛋白溶液在37C放置的半衰期仅几个小时。这种稳定性降低的原因常常是某些物理或化学因素破坏了维持蛋白质结构的天然状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失，这种现象称为蛋白质的变性。

第71页/共127页蛋白质不可逆失活的化学因素

强酸和强碱

强的酸碱可以改变蛋白质溶液的pH引起蛋白质表面必需基团的电离，使蛋白质的空间结构发生变化，造成蛋白质分子聚集，导致变性。

氧化剂

氧化剂甲硫氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基。酪氨酸侧链的酚羟基可以被氧化成醌再与巯基、氨基发生迈克尔加成反应形成交联产物。

表面活性剂变性剂

重金属离子去污剂与蛋白质表面的疏水区域结合，导致蛋白质伸展，分子内部的疏水性氨基酸残基暴露从而使蛋白质发生不可逆变性。

脲或盐酸胍与蛋白质多肽链作用，破坏了蛋白质分子内维持其二级结构和高级结构的氢键。有机溶剂也会引起蛋白质变性失活Hg2+、Cd2+、Pb2+能与蛋白质分子中的半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基以及色氨酸的吲哚基反应，使蛋白质不可逆沉淀而变性失活。

第72页/共127页三、化学物质对蛋白质的稳定作用

蛋白质的稳定性是指蛋白质抵抗各种因素的影响，保持其生物活性的能力。根据生物体内蛋白质等存在的状态，可以利用化学物质或化学方法使蛋白质稳定化，以有利于蛋白质在体外的应用。通过研究蛋白质的变性及稳定性，可以了解蛋白质的结构功能与稳定性的关系等。

第73页/共127页在蛋白质（酶）分离、纯化、储藏和应用中，可以通过化学方法使蛋白质稳定。其中常用的方法有以下几种：固定化：将酶或蛋白质多点连接于载体上（无机载体、高分子载体）；添加剂：保护蛋白质（酶）不受氧化剂氧化、不受变性剂变性等化学修饰：共价交联，使蛋白质构象固化。第74页/共127页稳定剂共溶剂

糖类，醇氨基酸及其衍生物无机盐，甘油，聚乙二醇等常用1-4M浓度共溶剂来稳定蛋白质和细胞器。抗氧化剂

底物、辅酶金属离子

化学交联剂半胱氨酸，2-巯基乙醇还原谷胱甘肽，二巯基赤藓醇等巯基试剂可防止巯基氧化植物抗氧化剂如儿茶酚黄酮等也具有保护作用酶可被底物辅酶、竞争性抑制剂及反应产物等所稳定。金属离子不仅可以影响酶的活性，还可以影响酶的稳定性如Ca2+多位点结合使得蛋白质分子成为紧密的活性形式。交联剂可在相隔较近的两个氨基酸残基之间，或蛋白质与其他分子之间（如固定化载体）发生交联反应使蛋白质的构象稳定。第75页/共127页四、化学物质的共价修饰作用

化学物质与生物大分子的共价作用常常涉及到物质的生理活性（包括药理、毒理等），如何判断化合物与蛋白质分子中的哪类基团作用，在体外主要用化合修饰的方法。该方法是研究蛋白质结构与功能的一种重要的基础手段。第76页/共127页生物体内蛋白质加合物的形成

许多化学毒物对细胞产生的损害与其亲电代谢产物同细胞大分子的亲核部位(如蛋白质的巯基)发生不可逆结合具有密切关系。当外源化合物的活性代谢产物与细胞内重要生物大分子，如核酸、蛋白质、脂质等共价结合，发生烷基化或芳基化，即导致DNA损伤、蛋白质正常功能丧失，乃至细胞的损伤或死亡、外源化合物与生物大分子相互作用主要有两种方式：非共价结合和共价结合。

第77页/共127页1，可与蛋白质发生反应的化合物

除少数烷化剂外，绝大多数外源化合物需经体内代谢活化，转变成亲电子的活性代谢物，再与细胞内生物大分子中的亲核部位和基团发生共价结合，例如蛋白质分子中的亲核基团、DNA、RNA及一些小分子物质如谷胱甘肽等的亲核部位等。

第78页/共127页2，蛋白质分子中的可反应基团

致癌物分子量的大小不同，反应是不同的，分子量较小的，如乙烯、丙烷和苯乙烯的氧化物、尿烷和氯乙烯的环氧化物、丙烯酰胺等，与蛋白质作用时，所形成的加合物依赖于外源化合物与各种氨基酸反应的相对速率。

第79页/共127页试剂类型化合物或前体反应机制烷基化芳香基化卤代物亲核取代环氧化物硫酸烷基酯活泼的烯烃1,4-加成羰基化合物醛形成席佛碱酰基化有机酸酐、酰氯等亲核取代或加成磷酰化有机磷亲核取代自由基·OH、·CCl3自由基反应具有亲电氮化合物芳香胺亲核取代第80页/共127页氨基酸残基侧链基团的修饰

蛋白质侧链基团的修饰是通过选择性的试剂或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团发生化合反应而实现的。其中的一个重要作用是用来探测活性部位的结构。理想情况下，修饰试剂只是有选则地与某一特定的残基反应，很少或几乎不引起蛋白质分子的构象变化。在此基础上，从该基团的修饰对蛋白质分子的生物活性所造成的影响，就可以推测出被修饰的残基在该蛋白质分子中的功能。

第81页/共127页巯基的化学修饰

5,5'-二硫-2-硝基苯甲酸(DTNB)，又称为Ellman试剂，目前已成为最常用的巯基修饰试剂。DTNB可以与巯基反应形成二硫键，产生的5-巯基-2-硝基苯甲酸阴离子在412nm具有很强的吸收，可以很容易通过光吸收的变化来监测反应的程度。有机汞试剂是最早使用的巯基修饰试剂之一，其中最常用的是对氯汞苯甲酸，该化合物溶于水中形成羟基衍生物，与巯基相互作用时在255nm处光吸收具有较大的增强效应。

第82页/共127页可以应用巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。二硫键的断裂方法

(a)过甲酸氧化法;(b)巯基还原法

第83页/共127页巯基的烷基化保护方法

用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。

第84页/共127页氨基的化学修饰

有许多化合物都可用来修饰赖氨酸残基，三硝基苯磺酸(TNBS)就是其中非常有效的一种。TNBS与赖氨酸残基反应，在420nm和367nm能够产生特定的光吸收。在蛋白质序列分析中，用于多肽链N-末端残基的测定的化合修饰方法--2，4-二硝基氟苯(DNFD)法、丹磺酰氯(DNS)法和)苯异硫氰酸酯(PITC)法都是常用的氨基修饰方法。

第85页/共127页Sanger法-2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物(DNP).在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。末端基氨基酸测定二硝基氟苯（DNFB）法第86页/共127页在碱性条件下，丹磺酰氯(二甲氨基萘磺酰氯)可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。末端基氨基酸测定丹磺酰氯法第87页/共127页Edman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。Edman氨基酸顺序分析法第88页/共127页第89页/共127页羧基的化学修饰

水溶性的碳化二亚胺类特定修饰蛋白质分子的羧基基团，目前已成为一种应用最普遍的标准方法，它在比较温和的条件下就可以进行。

第90页/共127页咪唑基的化合修饰

焦碳酸二乙酯(DPC)是最常用的修饰组氨酸残基的试剂。该试剂在接近中性的情况下表现出比较好的专一性，与组氨酸残基反应使咪唑基上的1个氮羧乙基化，并且使得在240nm处的光吸收增加。该取代反应在碱性条件下是可逆的，可以重新生成组氨酸残基。

第91页/共127页四、蛋白质光谱探针

蛋白质的定量测定是生物化学和其他生物学科中经常涉及的分析内容，也是临床诊断和检验疾病治疗效果的重要指标，还是药物和食品分析的常见项目。所谓蛋白质光谱探针，就是能与蛋白质发生相互作用的无机离子、有机小分子或络合物，这些物质与蛋白质结合生成超分子复合物之后，体系的光谱性质发生变化，从而可以提供蛋白质浓度或结构方面的信息。蛋白质的定量分析方法很多，但研究最多、应用最广的还是吸光光度法、荧光分析法和共振光散射等分子光谱探针。

第92页/共127页蛋白质吸光探针金属探针双缩脲在碱性溶液中与Cu2+生成紫红色化合物的反应。肽和蛋白质化合物都有双缩脲反应，生成紫红色化合物，在540nm具有光吸收。

双缩脲法Folin-Lowry法

将双缩脲试剂和Folin酚试剂(磷钼酸盐磷钨酸盐）结合使用，在蛋白质发生双缩脲反应之后，再和Folin酚试剂反应，此试剂在碱性条件下被蛋白质中酪氨酸的酚基还原，生成颜色更深的化合物，在640nm具有光吸收，可测定25-250ug蛋白质

双辛可宁酸法

在碱性条件下，肽键与铜离子反应生成Cu(I),Cu(I)再与BCA反应形成紫色络合物，在565nm测量吸光度。二喹啉甲酸（又称双辛可宁酸法的试剂比Folin-Lowry法的试剂稳定,干扰少第93页/共127页染料探针染料探针是蛋白质分析中种类最多应用最广的一类探针，该法是利用蛋白质与染料结合成沉淀或改变结合染料的光吸收特性，借助染料颜色的减退或变化的程度来测定蛋白质的含量。

溴酚蓝

是一种研究性能优良的探针试剂，该试剂颜色对比度为160nm,反应在pH3.2左右进行，在600nm测量吸光度。

考马斯亮蓝

在酸性条件下，染料考马斯亮兰G-250与蛋白质结合后其吸收峰从465移至595nm处，而颜色也由棕黄色转为深兰色。蛋白质与染料生成复合物颜色的深浅与其浓度成比例关系。该方法使用方便，反应时间短，染色稳定成为灵敏度最高的染料探针分析方法。

第94页/共127页第95页/共127页蛋白质荧光探针

蛋白质中存在着Tyr、Trp、Phe残基，能够吸收270～300nm的紫外光而发出紫外荧光。当测定体系中加入小分子配体时，小分子配体与蛋白质发生相互作用,会导致蛋白质荧光的猝灭，利用小分子配体对蛋白质内源荧光的猝灭这一现象可以确定蛋白质与小分子配体的作用类型及结合部位等。

第96页/共127页荧光探针的条件（1），探针分子与蛋白质分子的某一微区必需有特异性的结合，并且结合比较牢固；（2），探针的荧光必须对环境条件敏感；（3），蛋白质分子与探针结合后不影响其原来的结构和特性。在满足这些条件的基础上可进行蛋白质的测定及与金属离子结合的计量化学等。

常用的蛋白质荧光探针有：1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)、2-对甲苯胺基萘-6-磺酸(TNS)、1-(N-二甲胺)萘-5-磺酸(DNS)和荧光胺等。第97页/共127页1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)2-对甲苯胺基萘-6-磺酸(TNS),,,-4(对磺苯基)卟啉(TPPS4),,,-4(对羧苯基)卟啉(TCPP)

第98页/共127页第五节、蛋白质的分类

按照蛋白质的外形可分为球状蛋白质和纤维状蛋白质。球状蛋白质：globularprotein外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。纤维状蛋白质：fibrousprotein分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。一、依据蛋白质的外形分类第99页/共127页二、依据蛋白质的组成分类按照蛋白质的组成，可以分为简单蛋白(simpleprotein)和结合蛋白(conjugatedprotein)。第100页/共127页简单蛋白又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由-氨基酸组成的肽链，不含其它成分。1，清蛋白和球蛋白：albuminandglobulin广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。2，谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于70－80％乙醇中。3，精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。4，硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。第101页/共127页结合蛋白由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成，色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。如血清-，-脂蛋白等。核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。第102页/共127页三、依据蛋白质的功能分类

由于蛋白质在结构和功能上彼此存在着很大的差异，因此在任何一个简单的分类系统内要把握住各种蛋白质的重要特性或全部变化范围是很困难的。根据蛋白质功能的不同，可以将蛋白质分成以下类型：

第103页/共127页1，酶细胞的生长和繁殖、代谢物的合成和分解、能量的产生和利用，这些过程所需要的物质都是通过无数的化学反应提供的。所有这些化学反应几乎都能被称为酶的蛋白质所催化。第104页/共127页2，运输蛋白血红蛋白是了解得最清楚的一种蛋白质分子载体，它的主要功能是将氧从氧气充裕的肺内运出并输送到组织中去。第105页/共127页3，贮藏蛋白

贮藏蛋白与某些特定的物质结合后能将这些物质贮存起来。例如，有一种称为铁蛋白的蛋白质能将铁贮存在脾内。其他一些贮藏蛋白构成氨基酸的贮存库使氨基酸能在生长、发育期间作为营养物质释放出来例如鸡蛋中的卵白蛋白、牛奶中的酪蛋白以及小麦籽苗中的酵溶蛋白。

第106页/共127页4，收缩系统的蛋白质

脊椎动物的总质量中，大部分是骨骼肌。这一收缩系统的两种主要的蛋白质成分是肌球蛋白和肌动蛋白。肌肉收缩就是由这些互相联系的平行丝状蛋白质依靠能量进行滑动来完成的。具有双股螺旋结构的肌球蛋白分子集合成一束粗丝，它来回驱动主要成分是肌动蛋白的细丝。

第107页/共127页肌球蛋白和肌动蛋白第108页/共127页

在骨骼肌中与粗丝紧密缔合在一起的是细丝(thinfilament)，它由肌动蛋白组成。肌动蛋白以两种形式存在，球状肌动蛋白(G—肌动蛋白)和纤维状肌动蛋白(F—肌动蛋白)。纤维状肌动蛋白实际上是一根由G—肌动蛋白分子(分子量为46000)缔合而成的细丝。两根F—肌动蛋白细丝彼此卷曲形成双股绳索结构。第109页/共127页5，毒蛋白

有许多蛋白质具有毒性。例如，植物经常产生少量有毒的蛋白质来对付虫咬。很多动物的毒液内含有突触后或突触前的神经毒素，这些神经毒素都是一些由二硫键高度交联而成的小分子蛋白质。细菌毒素包括白喉毒素以及与厌氧肉毒梭菌所引起的细菌性食物中毒有关的毒素。第110页/共127页6，抗体-免疫球蛋白脊椎动物的主要防御系统之一是免疫系统，它能抵御外来的入侵物质诸如病毒、细菌以及其他机体的细胞。当称为抗原的外来物质(通常也是蛋白质)入侵后，免疫系统对此作出反应所产生和释放的蛋白质叫做抗体。抗体就是免疫球蛋