血红蛋白的提取与分离

血红蛋白的提取与分离第1页，共57页，2023年，2月20日，星期二思考1分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。思考2蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。第2页，共57页，2023年，2月20日，星期二思考3高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？变性、变性、空间结构思考4人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。第3页，共57页，2023年，2月20日，星期二一、基础知识：㈠凝胶色谱法（分配色谱法）：1、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）2、概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。第4页，共57页，2023年，2月20日，星期二3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢第5页，共57页，2023年，2月20日，星期二洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子

第6页，共57页，2023年，2月20日，星期二第7页，共57页，2023年，2月20日，星期二第8页，共57页，2023年，2月20日，星期二1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。㈡缓冲溶液：2、作用：能够抵制（）的对溶液的（）的影响，维持PH基本不变。外界的酸或碱PH值第9页，共57页，2023年，2月20日，星期二3、缓冲溶液的配制

通常由（）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（）就可以制得（）使用的缓冲液。1－2使用比例在不同PH范围内

思考：说出人体血液中缓冲对。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3第10页，共57页，2023年，2月20日，星期二思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）第11页，共57页，2023年，2月20日，星期二1）原理：不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。2）影响蛋白质分子运动速度的因素电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程思考：蛋白质为什么带有电荷？在一定的PH下，蛋白质可解离的基团会带上电荷㈢电泳：第12页，共57页，2023年，2月20日，星期二影响蛋白质分子运动速度的因素

决定运动方向电场作用力形成阻力决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小√√√√√√√第13页，共57页，2023年，2月20日，星期二③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电1、原理：第14页，共57页，2023年，2月20日，星期二聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲基双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵和催化剂（四甲基已二胺）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶测定（）通常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质相对分子质量2、常见方法琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳第15页，共57页，2023年，2月20日，星期二蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素②原理③

SDS作用为了消除净电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入SDS,SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小十二烷基磺酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量①应用第16页，共57页，2023年，2月20日，星期二为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入()。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是()。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于()。

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS单条肽链的分子量分子的大小第17页，共57页，2023年，2月20日，星期二电泳检测PCR结果琼脂糖凝胶电泳第18页，共57页，2023年，2月20日，星期二二实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定第19页，共57页，2023年，2月20日，星期二血液组成成分阅读思考：血液由______和________两部分组成。血细胞中_______细胞数量最多，细胞的含量最高的有机化合物是_____________。该化合物是由_____________和____________构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的______________________基团。血浆血细胞红细胞血红蛋白2条α-肽链2条β-肽链

亚铁血红素第20页，共57页，2023年，2月20日，星期二第21页，共57页，2023年，2月20日，星期二1.洗涤红细胞阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的方法是什么？洗涤干净的标志是什么？血液100mL3g柠檬酸钠低速离心2min红细胞血浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色其他血细胞第22页，共57页，2023年，2月20日，星期二2.释放血红蛋白阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？为了加速释放过程，采取了什么措施？目的分析：蒸馏水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分搅拌的目的是____________________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂第23页，共57页，2023年，2月20日，星期二①目的：去除（）②方法：（）离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的（），将下层（）的红细胞液体倒入（）每个肽链环绕（），此基团可携带（）。血红蛋白因含有（）而呈红色。本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。一个亚铁血红素基团一分子氧或一分子二氧化碳血红素(1)红细胞的洗涤杂质蛋白低速短时间黄色血浆暗红色烧杯第24页，共57页，2023年，2月20日，星期二再加入用（）的（）质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤⑤低速离心（低速短时间）⑥重复4、5步骤（）次，直至上清液中已没有（），表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。五倍体积生理盐水三黄色第25页，共57页，2023年，2月20日，星期二(2)血红蛋白的释放

加（）到（）体积，再加40％体积的（）（溶解细胞膜），置于（）上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白.(3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min，试管中的溶液分为4层:原血液甲苯磁力搅拌器蒸馏水第26页，共57页，2023年，2月20日，星期二第1层（最上层）：（）甲苯层第2层（中上层）：（）的沉淀层，（）色薄层固体第3层（中下层）：

（）的水溶液层（）的液体

第4层（最下层）：其它杂质（）的沉淀层无色透明脂溶性物质白血红蛋白红色透明暗红色第27页，共57页，2023年，2月20日，星期二滤纸过滤脂类物质3.分离血红蛋白分离过程红细胞混合液高速离心10min离心管烧杯有机溶剂血红蛋白第28页，共57页，2023年，2月20日，星期二取()ml的血红蛋白溶液装入（）中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的（）中，pH为（），透析12小时，目的是（）或用于更换样品中的（）。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。除去样品中分子量较小的杂质透析袋磷酸缓冲液7.0缓冲液4透析(粗分离)1第29页，共57页，2023年，2月20日，星期二第30页，共57页，2023年，2月20日，星期二纯化方法－－本实验采用凝胶色谱法1.凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱的装填：3.样品的加入和洗脱第31页，共57页，2023年，2月20日，星期二步骤操作要求①②③④⑤立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液计算称量凝胶固定色谱柱材料：交联葡聚糖凝胶G-75

20mmol/L磷酸缓冲液“G”表示什么？75代表什么？2、凝胶色谱柱的装填第32页，共57页，2023年，2月20日，星期二2.凝胶色谱制作1）凝胶色谱柱的制作①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；b、在橡皮塞顶部切出锅底状的（），在0.5ml的（）头部切下（）长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。凹穴移液管5cm第33页，共57页，2023年，2月20日，星期二底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。c.剪尼龙网小圆片覆盖在（）上，用（）的尼龙纱将橡皮塞（）包好，插到玻璃管一端。d、色谱柱下端用移液头部做（），连接一细的（），并用螺旋夹控制尼龙管的（），另一端放入收集（）的收集器内橡皮塞的凹面100目上部出口部位尼龙管打开与关闭色谱流出液第34页，共57页，2023年，2月20日，星期二⑤安装其他附属结构。③顶塞的制作：插入安装了玻璃管的橡皮塞④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。第35页，共57页，2023年，2月20日，星期二2）凝胶色谱柱填料的处理（1）凝胶的选择：（）（G-75）

“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。

75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。（2）方法：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于（）中充分溶胀后，配成（）。蒸馏水凝胶悬浮液交联葡聚糖凝胶第36页，共57页，2023年，2月20日，星期二①固定：将色谱柱处置固定在支架上②装填：将（）一次性的缓慢倒入（）内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。（3）凝胶色谱柱的装填方法凝胶悬浮液色谱柱注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。第37页，共57页，2023年，2月20日，星期二③洗涤平衡装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在()高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分（）12小时。

洗涤平衡注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。50cm第38页，共57页，2023年，2月20日，星期二3）样品加入与洗脱①加样前

打开下端出口，使柱内凝胶面上的（）缓慢下降到与（）平齐，关闭出口缓冲液凝胶面第39页，共57页，2023年，2月20日，星期二②加透析样品第40页，共57页，2023年，2月20日，星期二①调整缓冲液面：与凝胶面平齐②滴加透析样品：用（）将1ml（）的样品加到色谱柱的（）③样品渗入凝胶床：（）④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱⑤收集：待（）接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每（）收集一试管连续收集注意正确的加样操作：

①不要触及破坏凝胶面②贴壁加样

③使吸管管口沿管壁环绕移动吸管透析液顶端样品完全进凝胶层5ml红色的蛋白质第41页，共57页，2023年，2月20日，星期二3、样品的加入和洗脱

1.调液面2.加样

3.再调液面

4.洗脱5.收集缓冲液凝胶注意事项第42页，共57页，2023年，2月20日，星期二注意事项1、红细胞的洗涤：

洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2、色谱柱的装填：装完后，立即用缓冲液洗涤、平衡凝胶使装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。3、

凝胶的预处理：

沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡4、色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。

否则容易使白细胞、血小板、淋巴细胞等其他血细胞同红细胞一块儿沉淀，而无法将红细胞分离！第43页，共57页，2023年，2月20日，星期二血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。思考第44页，共57页，2023年，2月20日，星期二血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（）。思考样品的粗分离纯化纯度鉴定第45页，共57页，2023年，2月20日，星期二3.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳判断（）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。纯化第46页，共57页，2023年，2月20日，星期二3.SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度（1）试剂的配制①丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺

用去离子水配制29%（29g/100mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N,N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液②十二烷基硫酸钠（SDS）

用去离子水配成10%的贮存液，于室温保存。③用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液④TEMED：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。第47页，共57页，2023年，2月20日，星期二⑤用去离子水配制10%

过硫酸铵：作用提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。⑥Tris—甘氨酸电泳缓冲液

25mmol/LTris，250mmol/L甘氨酸(pH8.3)，0.1%的SDS。⑦样品处理液

50mmol/LTris—HCl(pH6.8)，100mmol/LDTT(巯基苏糖醇)或用5%的巯基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚蓝，10%的甘油。⑧染色液

0.1%的考马斯亮蓝R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸⑨脱色液

10%的甲醇和10%的冰醋酸。第48页，共57页，2023年，2月20日，星期二由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。因此在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。第49页，共57页，2023年，2月20日，星期二①SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备1)根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板2）SDS—聚丙烯酰胺凝胶制备用去离子水4.6mL，30%的丙烯酰胺2.7mL，1.5mol、pH8.8的Tris缓冲液2.5mL，10%的SDS0.1mL，10%的过硫酸胺0.1mL，TEMED0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm)，再在胶液面上小心注入一层水（约高2—3mm），以阻止氧气进入凝胶溶液。（2）电泳方法步骤第50页，共57页，2023年，2月20日，星期二③配制SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液。用去离子水2.7mL，30%的丙烯酰胺0.67mL，1.0mol、pH6.8的Tris缓冲液0.5mL，10%的SDS0.041mL，10%的过硫酸胺0.04mL，TEMED0.004mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。②分离胶聚合完全后（约30min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。3）样品处理第51页，共57页，2023年，2月20日，星期二5)加样在电泳