分子荧光分析法课件

一、

荧光分析的基本原理

二、荧光分析仪

三、分子荧光分析法及其应用

第三章

分子荧光分析法

molecularfluorescenceanalysis

2023/4/181575：西班牙植物学家N.Monardes观察到荧光现象1852：Stokes研究荧光，提出作为一种分析手段1867：Goppelsroder首次应用方法1880：提出荧与化学结构关系的经验法则1928：Jette和West第一台光电荧光计1952：第一台商品化的荧光分光光度计特点：1)灵敏度高（1-100ppb)：有的可达0.01ppb；2)选择性强；3)方法简单快速，用样量少;4)提供比较多的物理参数。3.1荧光分析的基本原理2023/4/183.1荧光分析的基本原理分子发光：处于基态的分子吸收能量（电、热、化学和光能等）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。荧光和磷光:

当紫外光照射某些物质时，由于这些物质结构的特殊性，会发出比吸收波长更长的不同波长的可见光，当紫外光照射停止时,随之消失的光叫做荧光，不立即消失的光叫磷光。2023/4/18去活化发射光子非辐射跃迁化学反应荧光磷光振动驰豫系间跨越内转换外转换激发光去除后，荧光立即消失激发光去除后，磷光不会立即消失熄灭或猝灭3.1荧光分析的基本原理3.1.1分子发光的产生2023/4/183.1.2激发光谱和发射光谱

激发光谱:固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）

激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二者完全相同！发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？吸收池光源检测器单色器信号显示系统单色器2023/4/18荧光激发光谱与发射光谱的特征a.Stokes位移在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。b.发射光谱的形状与激发波长无关分子被激发到高于S1的电子态的更高振动能级，然而由于内转换和振动弛豫的速率很快，很快损失多余的能量而衰变到S1电子态的最低振动能级尽管分子受激到达不同能级的激发态，不管激发波长如何，电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层，而与荧光体被激发至哪一个电子态无关。无论激发波长是λ1还是λ2，荧光的波长都是λ΄23.1.2激发光谱和发射光谱

激发光谱的形状与发射波长也无关2023/4/18ex=290nm(MAX)固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm(MAX)em=620nm(MAX)S04321S143211→

41→

31→

21→11

→41

→41

→21

→1c.

镜像规则

通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。

基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的各振动能级之间的跃迁和反跃迁几率相等2023/4/183.1.3荧光与分子结构的关系分子荧光产生的必备条件分子必须能够吸收激发光分子必须具有一定的荧光量子产率影响因素：荧光产生过程中，辐射和无辐射过程；与每一过程的速率常数有关；

kf

分子结构决定（内因）；主要取决于化学结构和化学环境和结构共同决定。2023/4/18n振动弛豫激发

n荧光（1）跃迁类型：具有电子跃迁类型的结构

跃迁是产生荧光的主要跃迁类型较大的摩尔吸光系数较短的激发态寿命10-7~10-9s串越至三重态几率小2023/4/18（3）具在刚性平面结构

0.9210.182023/4/181）给电子取代剂加强荧光（4）取代基效应—HN2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN产生p→π共轭二苯甲酮：弱荧光、强磷光S1→T1的系间窜跃产率接近1化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚λemmax(nm)278~310285~365310~405280~390285~345相对荧光强度10182020202）吸电子取代基减弱荧光、加强磷光—C=0，—COOH，—NO2不产生p→π共轭硝基苯：不产生荧光、弱磷光2023/4/18空间位阻对荧光发射的影响3）取代基的位置反式二苯乙烯强荧光物质F=0.75F=0.03立体异构体对荧光发射的影响顺式二苯乙烯非荧光物质2023/4/182023/4/183.1.4溶液的荧光强度1荧光强度与溶液浓度的关系当lc0.052023/4/182影响荧光强度的环境因素1）溶剂对荧光强度的影响一般溶剂效应介电常数、折射率特殊溶剂效应溶剂与荧光物质间的特殊作用溶剂相对介电常数荧光峰/nm荧光效率乙腈38.84100.064丙酮21.54050.055氯仿5.23980.041四氯化碳2.243900.002巯基喹啉在不同溶剂中的荧光峰和荧光效率极性增加，荧光效率增加；粘度增加，荧光效率增加2023/4/183）介质酸度的影响

2影响荧光强度的因素具酸或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，荧光体的存在型体不同，不同的型体(分子与其离子)在电子构型上有所不同，而且基态和激发态所表现出来的酸、碱性也有所差别

苯胺：弱的有机碱在碱性溶液pH7～12中以分子形式存在，蓝色强荧光在酸性pH<2或>13以离子形式存在，荧光弱。2023/4/183溶液荧光的猝灭荧光物质分子其它物质分子相互作用引起荧光强度降低的现象1）碰撞猝灭：荧光分子与淬灭剂分子碰撞2）静态猝灭：荧光分子与淬灭剂分子生成非荧光配合物3）转入三重态猝灭：引入溴、碘、溶解氧4）发生电荷转移反应的猝灭：甲基蓝与Fe2+5）荧光物质自猝灭2023/4/183.2荧光光谱仪吸收池光源检测器单色器信号显示系统3.2.1荧光光谱仪基本结构单色器与紫外-可见光谱仪的不同2023/4/18单色器第一单色器：在光源与样品池之间，滤去不需要的光，得到所需要的激发光。第二单色器：在样品池与检测器之间，滤去溶剂、容器表面散射光，瑞利和拉曼光以及杂质发出的散射光等，获得待测物质发射的荧光。

光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器问题：荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计有何异同点？2023/4/18检测器光电倍增管放大倍数：2n~5n;n=10,103~107，最大108~109样品池：液池、荧光池1.样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收池一样2.吸收池的形状：紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光荧光分光光度计的样品池四面透光波长范围3.使用注意事项容易破碎问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？沾污问题2023/4/183.3.4荧光分析法的应用1无机化合物的荧光分析衍生化法：与荧光试剂形成荧光配合物2023/4/183.3.4荧光分析法的应用2有机化合物的荧光分析3生物大分子的荧光分析直接法：可测定的化合物很少衍生化法：与荧光试剂形成共价化合物待测物试剂λexmaxλemmax测定范围ppm丙三醇苯胺紫外蓝色0.1~2糠醛蒽酮4655051.5~15氨基酸氧化酶3154250.01~50维生素A无水乙醇3454900~20蛋白质曙红丫紫外5400.06~6肾上腺素乙二胺4205250.001~0.02青霉素α-甲氧基-６-氯-９-(β-氨乙基)-氨基氮杂蒽4205000.0625~0.625玻璃酸梅3-乙酰氧基吲哚3954700.001~0.033胍基丁胺邻苯二醛3654700.05~5四氧嘧啶苯二胺36548510-42023/4/18一、什么是分子发光？分子发光有哪几类？二、分子荧光或磷光是如何产生的？三、什么是荧光激发光谱？什么是荧光发射光谱？各有何特点和作用？四、为什么荧光发射光谱与激发光波长无关？五、何谓Stokes位移？Stokes位移是如何产生的？六、分子产生荧光的必备条件是什么？七、什么是应光量子产率？什么样结构的化合物分子荧光量子产率高？十一、分子荧光光谱仪的激发和发射光