基因重组方法=全课件

3、基因重组基因重组（generecombination）是两个独立基因组内的遗传基因，通过交换与重新组合形成新的稳定基因组的过程。原核微生物基因组通常只是部分遗传物质的转移和重组，并且通过转化、接合和转导等形式进行；真核微生物的基因重组发生在有性繁殖过程中，通过减数分裂后整套染色体发生高频率交换（基因重组）在真核微生物中的部分真菌存在不通过减数分裂而在有丝分裂过程产生低频率基因重组的准性生殖方式

细菌的三种水平基因转移形式接合转导自然转化3.1

原核生物的基因重组接合(conjugation)：细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）转导(transduction)：由噬菌体介导自然遗传转化(naturalgenetictransformation)：游离DNA分子+感受态细胞中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（BernardDavis，1950）(2)机制(大肠杆菌的接合机制)接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导F因子的分子量通常为5×107，上面有编码细菌产生性菌毛（sexpili）及控制接合过程进行的20多个基因。含有F因子的细胞：“雄性”菌株（F+），其细胞表面有性菌毛不含F因子的细胞：“雌性”菌株（F-），细胞表面没有性菌毛F因子的四种细胞形式a）F-菌株，不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成雄性菌株（F+）；b）F+菌株，F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。d）F′菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。细胞表面同样有性菌毛。1）F+×F-杂交杂交的结果：给体细胞和受体细胞均成为F+细胞理化因子的处理可将F因子消除而使F+菌株变成F-菌株F+菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般不被转移。Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。2）Hfr×F-杂交Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与F-细胞进行接合。所不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区(leadingregion)结合着染色体DNA向受体细胞转移，F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中，故Hfr×F-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-。3）F′×F-杂交Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。F′×F-与F+×F-的不同：给体的部分染色体基因随F′一起转入受体细胞a）与染色体发生重组；b）继续存在于F′因子上，形成一种部分二倍体；细胞基因的这种转移过程又常称为性导（sexduction）、F因子转导（F-duction），或F因子媒介的转导（F-mediatedtransduction）。3.1.2细菌的转导（transduction）由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体细菌转导的二种类型：普遍性转导局限性转导沙门氏菌LT22A是携带P22噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌一个表面看起来的常规研究却导致一个惊奇和十分重要发现的重要例证！基因的传递很可能是由可透过“U”型管滤板的P22噬菌体介导的（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）管的中间用烧结玻璃滤板隔开，它只允许液体和比细菌小的颗粒通过管的右臂放溶源性细菌LA-22（受体），左臂放敏感菌LA-2（供体）用泵交替抽吸，使两端的液体来回流动LA-22端出现了原养型的个体（his+,try+）实验现象溶源性菌株LA-22中少数细胞在培养过程中自发释放出温和型噬菌体P22通过滤板感染另一端的敏感菌株LA-2LA-2裂解后，产生大量的“可滤过因子”，其中极少数在成熟过程中包裹了LA-2的DNA片段(含try+基因)通过滤板再度感染LA-22重组后得到原养型（his+,try+）的转导子转导噬菌体为什么“错”将宿主的DNA包裹进去?噬菌体的DNA包装酶酶也能识别染色体DNA上类似pac的位点并进行切割，以“headful”的包装机制包装进P22噬菌体外壳，形成只含宿主DNA的转导噬菌体颗粒（假噬菌体）。因为染色体上的pac与P22DNA的pac序列不完全相同，利用效率较低，这种“错装”机率一般仅约10-6-10-8形成转导颗粒的噬菌体可以是温和的也可以是烈性的，但必须具有能偶尔识别宿主DNA的包装机制并在宿主基因组完全降解以前进行包装。普遍性转导的基本要求：普遍性转导的三种后果：进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子流产转导（abortivetransduction）转导DNA不能进行重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。特点：在选择培养基平板上形成微小菌落外源DNA被降解，转导失败。DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。温和噬菌体λ裂解时的不正常切割：包含gal或bio基因（几率一般仅有10-6）缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的λDNA分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒。但没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力，感染受体细胞后，通过DNA整合进宿主染色体而形成稳定的转导子。局限性转导与普遍性转导的主要区别：a）被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接，与噬菌体DNA一起进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而普遍性转导包装的可能全部是宿主菌的基因。b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因导入受体，故称为局限性转导。而普遍性转导携带的宿主基因具有随机性。自然感受态与人工感受态的不同？自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内。

（该过程与细菌自身的遗传控制无关！）(1)自然遗传转化（简称自然转化）1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力进行自然转化，需要二方面必要的条件：建立了感受态的受体细胞外源游离DNA分子枯草芽孢杆菌的自然转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）分泌感受态因子与细胞表面受体M相互作用诱导特异蛋白质如自溶素表达使细胞表面的DNA结合蛋白及核酸酶裸露出来，使其具有与DNA结合的活性双链DNA与感受态细胞表面的特定位点吸附，DNA的一条单链被降解，另一条单链进入受体细胞，并与受体细胞染色体DNA的同源部分配对，接着受体染色体上相应单链片段被切除，并被外来的单链DNA交换、整合和取代，形成杂种DNA，自然转化过程的特点：a）对核酸酶敏感；c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化（DNA）给体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多；提高质粒的自然转化效率的二种方法：1）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有活性的质粒的几率大大提高；2）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒转化进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌-------重组获救b）不需要活的DNA给体细胞；噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒转染(transfection)：现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。特点：接合(conjugation)：细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）转导(transduction)：由噬菌体介导自然遗传转化(naturalgenetictransformation)：游离DNA分子+感受态细胞“接合”“转导”及“自然转化”这三种在自然界中存在的细菌遗传重组过程各自的特点：a）外源DNA的来源及进入途径有差异；b）决定因素也各有不同；(2)人工转化用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。不是由细菌自身的基因所控制；用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。质粒的转化效率高；在自然环境中，真核微生物就存在有性生殖和准性生殖等基因重组的形式。酵母菌有性杂交霉菌的准性杂交3.2

真核生物的基因重组3.2.1酵母菌的有性杂交酵母菌的生活史既包括二倍体、单倍体世代，又包括有性和无性世代。二倍体单倍体减数分裂形成子囊孢子每个子囊中含有四个单倍体的子囊孢子酿酒酵母的双倍体和单倍体细胞比较酿酒酵母两种接合型α和a（单倍体）融合二倍体细胞(α/a)酿酒酵母接合型是由自身的遗传特性决定的受MAT活性区调控，由MAT启动子控制基因α插入该座位，那么细胞就是接合型αa基因插入则是a型α和a基因是不表达的沉默基因，只在发生接合型（单倍体）转变时用作α或a基因插入的来源3.2.2霉菌的生殖霉菌的基因重组一般也可以通过有性生殖或准性生殖过程完成准性生殖是指不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程异核体的形成、二倍体的形成以及体细胞交换和单倍体化霉菌的有性生殖有性孢子繁殖两个性细胞结合产生新个体的过程a）质配：两个性细胞结合，细胞质融合，成为双核细胞，每个核均含单倍染色体（n+n）。b）核配：两个核融合，成为二倍体接合子核，此时核的