蛋白质与DNA的相互作用课件

蛋白质与DNA的相互作用

分类：与单链RNA结合与茎环结构结合与双链DNA结合：普遍性结合特异性结合蛋白质与DNA结合的特性：1.DNA识别部位有二度对称性。蛋白质一般是有二度对称结构的二聚体，两个单体具有旋转对称性，与硷基的旋转对称吻合。2.蛋白质和DNA的接触区只在DNA的一侧。3.在结合过程中，蛋白质和DNA都有构像改变。4.普遍性结合：蛋白质中带正电荷氨基酸与DNA骨架的磷酸基团形成离子键。5.特异性结合：识别螺旋区内氨基酸与DNA特定硷基接触。1.蛋白质和DNA都存在0.7nm的重复距离DNA双螺旋单链相邻磷酸基团间的距离是0.7nm。

β—折叠，N原子间距离是0.7nm伸展β—折叠Cβ间距离是0.7nm

α—螺旋，Arg和Lys被另外三个残基隔开，带正电荷侧链的距离是0.7nm.2.DNA对称性平移对称：GCATCTGCATCTCGTAGACGTAGA

二重轴对称GCATCTTCTACGCGTAGAAGATGC二重旋转对称

GCATCTAGATGCCGTAGATCTACG旋转对称GCATCTCGTACACGTAGAGCATGT

蛋白质与DNA特异性结合中DNA特点：大沟内存在特异性识别信息氨基酸与碱基对共平面氨基酸和碱基对之间形成氢键NNOHNNNHNNONHCOOCCNHHNHHHGluAgrH蛋白质与DNA普遍结合中蛋白质特点：

β-折叠结构的带正电荷残基与磷酸集团结合可能是通过识别小沟结构实现1.富含脯氨酸和碱性氨基酸组蛋白有重复的SPKKSer/Thr-Pro-Lys/ArgLys/ArgPRGRP序列与A-T碱基对结合KPRGRPK序列也能与小沟A-T结合2.碱性螺旋组蛋白H1C端57个氨基酸Lys和Gly,Lys在螺旋两侧，Gly夹在中间

蛋白质与DNA特异性结合中蛋白质特点：1.蛋白质多形成二聚体HTH复合物亮氨酸拉链结构NH2COOH碱性氨基酸Agr和Lys锌指结构Agr和G形成氢键快速抽提裂解液：提取液：10mMHRPES250mMTris1mMEDTA60mMKCl60mMKCl1mMDTT1mMDTT1mMPMSF1mMPMSFpH7.90.5%NP-40pH7.91X107细胞100ul裂解液、冰浴5分钟、离心沉淀用不含NP-40的裂解液洗一次100ul提取缓冲液干冰异丙醇速冻，反复冻融3次离心沉淀—800C保存

凝胶滞后试验DNA足迹分析DNA足迹分析随机PCR凝胶阻滞试验：蛋白质和DNA结不结合，不能确定结合的序列DNA足迹分析：蛋白质结合DNA的序列不能确定序列硷基变化对结合的影响随机PCR:结合序列硷基变化对结合的影响寡核苷酸设计与合成：1.AAGAATTC—NNNNNNNNN—GGATCCAA2.引物合成3.标准结合反应寡核苷酸的合成4.电泳回收探针标记：合成的含随机序列的单链寡核苷酸3‘引物

32PdCTPdNTP(不包括dCTP)Klenow酶电泳纯化凝胶阻滞试验纯化探针1.蛋白质与标准结合寡核苷酸结合蛋白质与随机寡核苷酸结合电泳（样品隔开，防污染）2.凝胶回收3.酚、氯仿去蛋白4.PCR（底物加32PdCTP）5.PCR产物再做凝胶阻滞试验，反复纯化特异结合序列的克隆和序列分析：酶切随机核苷酸序列与质粒重组用引物对质粒序列进行分析N1N2N3N4N5A14/0.3213/0.304/0.115/0.1114/0.32C9/0.2112/0.2723/0.5226/0.597/0.16G4/0.016/0.146/0.149/0.2119/0.43T17/0.3913/0.3011/0.254/0.014/0.01T/AA/T/CCCG/A超过50%：确定不可替换25-50%：两种硷基可替换小于25%：没有硷基特异性

SouthWestern杂交试验确定与