温室粉虱伪蛹羽化统计及烟粉虱携带TYLCV情况检测,昆虫学论文

温室粉虱伪蛹羽化统计及烟粉虱携带TYLCV情况检测,昆虫学论文温室白粉虱Trialeurodesvaporariorum〔Westwood〕和烟粉虱Bemisiatabaci〔Gennadius〕均是重要的世界性昆虫，它们的寄主范围非常广泛，主要危害棉花、蔬菜和花卉等植物。两者危害特征极为类似，均能够通过直接刺吸植物汁液致使植株衰弱矮小，分泌蜜露诱发煤污病，影响植物光合作用，导致作物产量和品质下降，以及传播病毒等多种方式对农业生产造成直接或间接的危害〔Brownetal.,1995;李清西等，1997;胡敦孝等，2001〕.与温室白粉虱比拟，烟粉虱寄主范围更广泛、适应性更强、危害更严重、抗药性更强〔杨秀清等，2001〕.烟粉虱还是传播双生病毒如番茄黄化曲叶病毒〔TYLCV〕、番茄班驳病毒〔ToMoV〕、撒丁岛番茄黄化曲叶病毒〔TYLCSV〕等很多植物病毒的重要媒介〔纠敏等，2006〕.烟粉虱是含有多种生物型/隐蔽种的复合种，华而不实B型与Q型是入侵性较强、分布较广的2种。相对于B型烟粉虱，Q型烟粉虱对很多农药尤其对新烟碱类农药具有更强更稳定的抗药性，还具有更强的传毒能力〔褚栋等，2007;Panetal.,2020;Liuetal.,2020〕.昆虫的越冬是长期适应自然条件及季节变迁、完成生活史的一种生活对策。昆虫越冬基数的大小以及越冬后能否在早春适宜的发育温度下正常羽化将决定着来年该虫的发生及危害程度。已有的研究表示清楚，随着温室、大棚等保温栽培设施的大量出现，烟粉虱能够在我们国家从南到北的温室、大棚内越冬〔崔洪莹等，2018;张万民等，2020〕.我们前期调查发现辽宁省温室白粉虱与烟粉虱伪蛹能在最冷月份〔1月〕的温室大棚内存活〔张万民等，2020〕;在该地区所有采集的烟粉虱样品中，Q型烟粉虱所占比例远远超过B型。同时，发现越冬的烟粉虱伪蛹携带双生病毒-番茄黄化曲叶病毒〔Tomatoyellowleafcurlvirus,TYLCV〕〔张万民等，2020〕.那么，2种越冬粉虱伪蛹在早春温度升高后能否能够正常羽化及生长发育，烟粉虱伪蛹羽化成虫是否仍然携带TYLCV,尚需进一步的系统调查。该方面的研究是科学制定烟粉虱防治技术方案的基础，同时对于番茄黄化曲叶病毒病的早春防控也具有重要的指导意义。为了进一步明确温室内越冬后的粉虱伪蛹早春能否正常发育以及烟粉虱携带TYLCV的情况，我们于2020年4月份中旬〔可揭棚的时期〕在辽宁省部分县市区的温室作物上采集了粉虱伪蛹，通过在显微镜下的观察统计了粉虱伪蛹羽化情况；鉴别了粉虱种类并对烟粉虱生物型进行了鉴定；然后检测了新羽化烟粉虱携带TYLCV的情况。1材料与方式方法1.1供试虫源采集试验所用的粉虱伪蛹均是在2020年4月中旬采自于辽宁省部分县市区的温室作物上。摘取有粉虱伪蛹的寄主植物叶片〔一个地点至少采集10片作为一份样品〕,然后将寄主叶片带入实验室进行观察鉴定，其采集地点、寄主作物及样品代码如表1所示。【表1】1.2粉虱羽化率每样品随机挑取30头活的粉虱伪蛹于另一新鲜寄主叶片，放在垫有两层滤纸的培养皿〔加数滴水保持一定湿度〕中让其羽化。天天观察粉虱伪蛹的羽化情况〔直到不再有伪蛹羽化为止〕,并记录羽化的粉虱数量。1.3鉴定粉虱种类在辽宁省部分地区所采集的每个样品中随机取15头羽化出的粉虱成虫〔JP1地区取14头〕.将粉虱成虫标本放在载玻片上，将其置于Nikon光学显微镜下〔目镜16、物镜10〕,不使用电源光，仅在自然光较亮的环境下，调整好成虫的复眼角度进行观察，比拟种间复眼形态构造的差异以确定粉虱种类〔褚栋等，2008〕,分别记录2种粉虱的数量〔表1〕.同时，利用能够鉴别温室白粉虱与烟粉虱的特异性引物进一步进行了区分〔专利申请号：202010192726.5〕.1.4烟粉虱生物型鉴定将鉴定出的烟粉虱利用PCR-RFLP方式方法快速鉴别其B型与Q型〔Chuetal.,2018〕.单头烟粉虱DNA提取方式方法参照褚栋等〔2005〕,烟粉虱mtCOI片段扩增参照Chu等〔2018〕,所用引物为Cl-J-2195〔5-TTBATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3〕和R-BQ-2819〔5-CTGAATATCGAGGCATTCC-3〕,扩增产物大小为620bp左右。分别以已经知道B型、Q型烟粉虱DNA为模板进行PCR作为B型、Q型烟粉虱的对照。PCR产物酶切后以1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后在紫外透视仪上观察，记录结果。每份样品检测10头〔华而不实鞍山岫岩XY样品含有6头〕.同时，为了进一步确定烟粉虱生物型，每份样品的3头烟粉虱的mtCOI的PCR产物直接进行双向测序。1.5烟粉虱携带TYCLV检测使用TYLCV特异引物〔上游引物5-CGCCCGTCTCGAAGGTTC-3下游引物5-GCCATATACAATAACAAGGC-3〕〔Picetal.,1988〕对14份样品中的烟粉虱进行PCR扩增，每份样品中所有烟粉虱进行检测〔华而不实鞍山岫岩XY样品含有6头〕,反应体系参照Picetal.〔1998〕.以已经知道TYLCV基因组为模板作为阳性对照，以水为模板作为阴性对照。取5LPCR产物，在1.0%琼脂糖上电泳后，EB染色，凝胶成像观察。2结果与分析2.1粉虱羽化率与物种粉虱的羽化率统计结果显示〔图1〕,辽宁省14份伪蛹样品均可羽化，平均羽化率77%;华而不实，4份样品的羽化率较高〔比例90%〕,分别为锦州TH1、葫芦岛LSH1、葫芦岛LSH2和葫芦岛LSH3.仅有一份样品的羽化率低于50%,为朝阳JP1样品。【图1】通过复眼镜检法鉴别粉虱种类发现〔表1〕,辽宁省14份样品中，10份样品为烟粉虱种群，仅4份样品为烟粉虱和温室白粉虱混合种群〔占样品比例29%〕,分别为鞍山岫岩XY样品、大连WFD样品、葫芦岛LSH1样品和盘锦DW样品。并且4份混合种群样品中，仅在鞍山岫岩XY样品中温室白粉虱占优势〔比例50%〕.2.2烟粉虱生物型鉴定及携毒检测通过mtCOI基因片段对辽宁部分地区烟粉虱生物型进行鉴定及系统分析〔图2〕,所有检出的烟粉虱中只检测到了B型和Q型烟粉虱。PCR-RFLP方式方法表示清楚，在14烟粉虱样品〔包括烟粉虱与温室白粉虱混合样品〕中，仅有2份样品为B型与Q型混合样品，为盘锦DW样品和丹东FCH1样品〔表1〕,并且在2份样品中Q型烟粉虱均占优势〔比例50%〕,其他12份烟粉虱样品生物型均为Q型。利用PCR检测新羽化烟粉虱体内TYLCV的检测，发现14份样品中的所有烟粉虱体内均未检测到TYLCV的存在。【图2】3结论与讨论本研究研究发现辽宁省部分地区保卫地内的粉虱〔含有温室白粉虱与烟粉虱〕早春时期能够正常羽化〔羽化率范围为47%-93%〕.这与崔洪莹等〔2018〕田间观察结果是一致的。崔洪莹等〔2018〕研究发现烟粉虱能够在中国越冬北界分布线以北地区的双膜覆盖大棚和日光温室等保卫地设施中越冬。本研究还发现，成功羽化的粉虱在多数样品中是以烟粉虱为主，表示清楚当下辽宁省保卫地内烟粉虱种群逐步演变为优势粉虱种群。这与露地作物生长季节田间粉虱调查是一致的〔张万民等，2020〕.同时，在烟粉虱样品中，Q型烟粉虱所占比例远远高于B型占据主导地位，这与辽宁省2018年与2020年露地作物生长季节烟粉虱生物型调查结果也是一致的〔张万民等，2020〕.这些结果提示，早春羽化后粉虱种类及烟粉虱生物型与次年粉虱的发生动态是密切相关的。本研究发现，在早春成功羽化的烟粉虱体内没有检测到TYLCV,这可能与寄主、虫龄及研究的种群数量等相关。首先，本次研究的烟粉虱种群寄主植物中，TYLCV传播寄主植物如番茄等较少，可能导致TYLCV毒源缺乏，进而使烟粉虱获毒概率减小，这可能成为我们没有检测到TYLCV的主要原因之一。Ghanim等〔1998〕发现取食TYLCV的烟粉虱在棉花与茄子上的各个龄期以及下一代成虫仍然携带该病毒。假如番茄寄主较多，其体内含有TYLCV的概率会较大，下一代成虫可能携带该病毒的概率也会较大。新羽化成虫可以能在很短的时间内能够通过取食携毒植物来获取TYLCV〔纠敏等，2006〕.张万民等〔2020〕研究发现辽宁省越冬温室内的烟粉虱伪蛹体内含有TYLCV,其采集的烟粉虱种群大多数来自于番茄寄主。这在一定程度上讲明了烟粉虱体内的TYLCV的检出率与采集的植物能否为TYLCV感染寄主有关。其次，由于烟粉虱传播TYLCV出现了依靠虫龄传播的形式，携带TYLCV的烟粉虱成虫能够将病毒垂直传播到第一代后代的卵期并且这段未成熟的时期是其传播TYLCV频率最高的阶段，而随着烟粉虱虫龄的增大，其传播频率却在不断地减小，在同一代的烟粉虱蛹期和成虫期就已经无法检测到TYLCV.出现这一现象的可能解释是随着烟粉虱虫龄的增大体内免疫反响被激活，包括抗菌肽和自噬性溶酶体的产生，导致烟粉虱体内病毒浓度逐步降低，进而使TYLCV仅在未成熟的卵期及幼虫期能够存在，而到了蛹期和成虫期逐步降低直至消