高效液相色谱技术在食品营养中的应用

高效液相色谱技术在食品营养中的应用第1页，共32页，2023年，2月20日，星期二高效液相色谱技术是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱。又因分析速度快而称为高速液相色谱。

高效液相色谱法定义：第2页，共32页，2023年，2月20日，星期二溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationaryphase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法

高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。原理及应用领域：第3页，共32页，2023年，2月20日，星期二①高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。②高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。③高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng,进样量在μL数量级。④应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。

高效液相色谱法特点————“三高一广一快”⑤分析速度快、载液流速快：较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。第4页，共32页，2023年，2月20日，星期二●高效液相色谱法主要类型：

液固吸附色谱1液液分配色谱2凝胶色谱4键合相色谱3第5页，共32页，2023年，2月20日，星期二一.液固吸附色谱

1.1分离原理液固色谱是基于各组分吸附能力的差异进行混合物分离的，其固定相是固体吸附剂。

1.2固定相吸附色谱固定相可以分为极性和非极性两大类。1.3流动相流动相要求：

①选用的溶剂应当与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性

②选用的溶剂应有高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱性能的改变。

③选用的溶剂性能应与所使用的检测器相匹配，如果使用紫外吸收检测器，就不能选用在检测波长下有紫外吸收的溶剂；若使用示差折光检测器，就不能用梯度洗脱。目录第6页，共32页，2023年，2月20日，星期二市场价格：11000RMB/吨纯度99%以上，含氮量高达66%纯牛奶的蛋白质含量约为2.9%左右，而一般蛋白质含氮量16%。在检出三聚氰胺的产品中，石家庄三鹿牌婴幼儿配方奶粉三聚氰胺含量很高，其中最高的达2563mg/kg，其他在0.09-619mg/kg之间。第7页，共32页，2023年，2月20日，星期二第8页，共32页，2023年，2月20日，星期二二、保健食品中主要功效成分的检测方法及原理第9页，共32页，2023年，2月20日，星期二第10页，共32页，2023年，2月20日，星期二传统测蛋白质的方法—凯氏定氮法是根据测定样品中的含氮量来计算其中的蛋白质的含量：含氮量×6.256.25为蛋白质的含氮系数三聚氰胺事件发生的原因：(1)检测方法的局限性！(2)利益的趋势！(3)科学普及的不足性！第11页，共32页，2023年，2月20日，星期二HPLC法检测功效成分的原理和方法第12页，共32页，2023年，2月20日，星期二●高效液相色谱法的特点:热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高压高效高速高沸点第13页，共32页，2023年，2月20日，星期二流程及主要部件1.流程第14页，共32页，2023年，2月20日，星期二2.主要部件

主要部件之一，压力：150～350×105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性(1)高压输液泵第15页，共32页，2023年，2月20日，星期二(2)梯度淋洗装置外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。第16页，共32页，2023年，2月20日，星期二(3)进样装置

流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：第17页，共32页，2023年，2月20日，星期二(4)液相色谱检测器

a.紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。

特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。第18页，共32页，2023年，2月20日，星期二b.光电二极管阵列检测器

紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。第19页，共32页，2023年，2月20日，星期二光电二极管阵列检测器第20页，共32页，2023年，2月20日，星期二c.示差折光检测器

除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比

通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种；第21页，共32页，2023年，2月20日，星期二d.荧光检测器对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；

高灵敏度！高选择性！第22页，共32页，2023年，2月20日，星期二Ⅱ高效液相色谱法(HPLC)检测青蒿素含量一．实验原理

HPLC原理：利用样品分子在固定相（填料柱）和流动相之间相互作用力大小不同而实现分离。高压可提高溶质组分移动速度。按溶质组分与固定相之间的作用机理分类：①吸附分配作用：反相、正相和疏水性色谱；②电荷作用：不同类型的离子交换色谱；③空间排阻作用：凝胶过滤和凝胶渗透色谱；④生物特异性作用：亲和色谱。第23页，共32页，2023年，2月20日，星期二流动相——极性溶剂酸性、低离子强度水溶液，加入一定比例的能与水互溶的有机改性剂，如乙腈、甲醇、异丙醇等有机溶剂

；

固定相——非极性填料孔径30纳米以上的烷基键合硅胶填料：短链烷基（如C4、C8和苯基）；长链烷基（如C18、C22）烷基的链越长，固定相的疏水性越强，流动相中加入与水互溶的有机溶剂，以提高洗脱速度。反相高效液相色谱（RP-HPLC）机理：利用溶质组分与固定相间疏水作用力不同而分离。第24页，共32页，2023年，2月20日，星期二流动相——极性溶剂；固定相——非极性填料组分性质作用力固定相流动相移动速度保留时间A组分B组分非极性强非极性弱大小小大

慢长

快短青蒿素碱性溶液定量生成α•β—不饱和酮酸盐

酸化稳定的化合物，在260nm处有吸收峰，可用高效液相色谱紫外法检测。第25页，共32页，2023年，2月20日，星期二二.操作方法溶液配制：1．0.2%NaOH溶液500ml：称取1.00gNaOH去离子水溶解

500ml；2．0.08mol/L醋酸溶液：

吸取冰醋酸2.30ml去离子水500ml

3．0.01mol/LNa2HPO4-NaH2PO4pH7.0缓冲液（流动相）：称取Na2HPO4·12H2O固体1.79g蒸馏水500ml称取NaH2PO4·12H2O固体0.68g蒸馏水500ml混合，调pH7.04.

1.00mg/ml青蒿素标准液：精确称取50.0mg青蒿素标准品无水乙醇

50ml（容量瓶）5.样品液：分别精确称取青蒿素粗品50、100、150mg于10ml具塞试管中无水乙醇5ml超声波振荡促溶→转移至10ml容量瓶中

无水乙醇10ml第26页，共32页，2023年，2月20日，星期二流动相处理:微滤器（膜孔0.22μm）

pH7.0磷酸缓冲液

超声波振荡器脱气15min

HPLC进样器第27页，共32页，2023年，2月20日，星期二10ml具塞试管进样液制备：样品液(标准液)1.00ml

0.2%NaOH溶液4.00ml

45℃水浴反应30min

冷水浴冷却至室温

0.08mol/L醋酸5.00ml

针头微滤器(0.2μm)注射器吸进样液1ml第28页，共32页，2023年，2月20日，星期二恒流泵A恒流泵B紫外检测仪A液水相B液有机相LC-100液相色谱仪

进样器色谱柱第29页，共32页，2023年，2月20日，星期二液相色谱仪的启动顺序：打开排空阀，抽出流动相，排除空气打开高压泵和检测器的电源开关，检测器自动开始自检启动电脑；插入U盘，软件自动初始化；设置波长。

设置总流量、A和B两液的比例、泵压、启动泵。设置自动停止时间、各项屏显参数、文件名及保存路径。

先通入流动相冲洗管路系统，基线走直后，进样20μl

第30页，共32页，2023年，2月20日，星期二HPLC的图形结果色谱图(Chromatogram):色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为时间←色谱峰时间(分)基线↓峰高峰宽响应值第31页，共32页，2023年，2月20日，星期二液相色谱图名词术语(1)色谱图名词术语:色谱峰(Peak):色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号峰底(P