实验二细菌涂抹片的制备和革兰氏染色

实验二细菌涂抹片的制备和革兰氏染色第1页，共12页，2023年，2月20日，星期六目的要求：1、掌握细菌抹片的制备方法和常用染色方法。

2、认识革兰氏染色和抗酸性染色的反应特性。实验内容：1、

细菌抹片的制备：玻片准备：透明、洁净、无油渍。抹片：液体材料、非液体材料、组织脏器材料的抹片方法讲解、示范。干燥固定：火焰固定和化学固定的示范。讲解其目的及注意事项。2、

细菌涂片的制备：讲解并示范涂片、干燥、固定的方法。3、

细菌常用染色方法：革兰氏染色法

细菌抹片的制备第2页，共12页，2023年，2月20日，星期六革兰氏染色法：

1.制片：取待检病料或细菌培养物常规抹（涂）片、干燥、固定。

2.初染：滴加结晶紫，染色1-2分钟，水洗。

3.媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1分钟，水洗。

4.脱色：用滤纸吸取或甩去载玻片上的残水，将载玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时（20—30秒），立即水洗。5.复染：用复红液复染约2分钟，水洗。

6.镜检：用滤纸吸水，干燥后，显微镜油镜观察。第3页，共12页，2023年，2月20日，星期六革兰氏染色法原理：

革兰氏染色法将细菌分为G＋和G-，这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。用乙醇脱色处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。G＋细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使得结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色。G-细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以在脱色处理时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的颜色。

第4页，共12页，2023年，2月20日，星期六G+菌与G-菌细胞壁的区别

细胞壁革兰阳性菌革兰阴性菌

强度较坚韧较疏松厚度21~80nm10~15nm肽聚糖层可达50层1~2层肽聚糖量50%~80%5%~80%糖类量约45%15%~20%脂类量1%~4%11~22%磷壁酸﹢﹣外膜﹣﹢第5页，共12页，2023年，2月20日，星期六革兰氏染色法过程示意图革兰氏染色法动画第6页，共12页，2023年，2月20日，星期六革兰阳性菌革兰阴性菌第7页，共12页，2023年，2月20日，星期六第8页，共12页，2023年，2月20日，星期六革兰氏染色法革兰氏染色法动画实验报告：

1、细菌抹片或涂片革兰氏染色的显微镜观察结果。

2、革兰氏染色法的具体程序和注意事项。第9页，共12页，2023年，2月20日，星期六涂片干燥固定染色1~2min水洗、吸干镜检细菌的单染色第10页，共12页，2023年，2月20日，星期六细菌抗酸染色1.初染:用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用水冲洗。

2.脱色:3%盐酸酒精脱色30秒~1分钟；用水冲洗。