实验八微生物的接种技术及分离纯化

实验八微生物的接种技术及分离纯化第1页，共21页，2023年，2月20日，星期六

1．掌握倒平板的方法和几种分离纯化微生物的基本操作技术。

2．学习平板菌落计数的基本原理和方法

一、目的要求第2页，共21页，2023年，2月20日，星期六实验原理1.从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。本实验采用平板分离法：

1)选择合适的选择培养基。

2)通过稀释倒平板和平板划线等技术得到单个菌落。

2.平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，取一定量的稀释液接种在平板上，经过培养，平板上出现单个菌落，即为一个菌落形成单位（colony-formingunits,cfu）。第3页，共21页，2023年，2月20日，星期六第4页，共21页，2023年，2月20日，星期六吸取稀释液

取一吸管，以无菌操作法分别吸取10－5、10－6、

10－7土壤稀释液0.1mL，加在已制好的平板培养基上。涂板

用玻璃刮刀将稀释液在培养基上充分混匀铺平，倒置于恒温箱培养。计算出每克土壤中细菌的数量。

即用某一培养皿内的菌落数乘以该培养皿接种液的稀释倍数即得。挑取单个菌落，进行划线分离。微生物的分离—平板涂布法第5页，共21页，2023年，2月20日，星期六第6页，共21页，2023年，2月20日，星期六微生物的分离—平板倾注法吸取稀释液

取一吸管，以无菌操作法分别吸取10－4、10－5、

10－6土壤稀释液0.5-1mL，加在空培养皿中。混和摇匀

水平轻轻转动培养皿，使菌液、培养基充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后倒置于恒温培养箱培养。计算出每克土壤中放线菌的数量。挑取单个菌落，进行划线分离。第7页，共21页，2023年，2月20日，星期六微生物的分离—平板划线法制成平板。凝固后，用接种环取相应的菌液一环（10－1）在平板上划线。

1.连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划线。完毕后，倒置于28～300C温室培养。

2.分区划线法：用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，先在培养基的一边作第一次平行划线3—4条，再转动培养皿约60度角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次划线会，同法依次作第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置于温室培养。挑取单个菌落接种于斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，最后得到纯培养。第8页，共21页，2023年，2月20日，星期六第9页，共21页，2023年，2月20日，星期六第10页，共21页，2023年，2月20日，星期六实验材料样品：新鲜土壤。培养基：灭菌的淀粉琼脂培养基、牛肉膏蛋白胨培养基。无菌水：带有玻璃珠装有99mL无菌水三角瓶、装有4.5mL无菌水的试管。其它：无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、电子天平、记号笔、接种环、酒精灯、火柴。第11页，共21页，2023年，2月20日，星期六实验步骤1．制备土壤稀释液称取土样1g，放入盛有99ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇混匀。2．10倍梯度稀释用无菌吸管吸取上述土壤稀释液0.5ml加入盛有4.5ml无菌水的试管中充分混匀，然后再用无菌吸管从此试管中吸取0.5ml加入盛有4.5ml无菌水的另一支试管中充分混匀，以次类推制成10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的溶液。一、土壤中细菌的分离、纯化及菌落计数（6皿/组）第12页，共21页，2023年，2月20日，星期六第13页，共21页，2023年，2月20日，星期六3．涂布选择3个连续梯度（10-4、10-5、10-6），每个稀释度涂布2个平板，涂布时用无菌吸管每个平板滴加0.1mL，用无菌玻棒涂布均匀。4．培养37℃倒置培养过夜。5．计数并检验产胞外淀粉酶的菌株

总菌落计数完后，将平板内滴加1-2ml卢戈氏碘液，菌落周围产生透明圈的菌落就是产胞外淀粉酶的菌株，观察并计数第14页，共21页，2023年，2月20日，星期六二、划线分离

平板的制作（牛肉膏蛋白胨培养基）将15ml培养基无菌条件下倒平板，待其凝固后备用（4皿/组）划线分离：取枯草杆菌和金黄色葡萄球菌混合菌悬液一环，采用连续划线或分区划线的方法分离单菌落第15页，共21页，2023年，2月20日，星期六（1）计算相同稀释度的平均菌落数

有较大片菌苔生长时，弃用；以无片菌苔生长的平皿计数。

若片菌苔大小不到培养皿的一半，其余一半分布均匀，将此一半计数×2

（2）选择平均菌落数在30～300之间的平板

只有一个符合此范围时，以该平均菌落数乘稀释倍数。

有两个在30～300间时，按两者菌落总数比值决定：比值小于2，取平均；比值大于2，取较小的菌落总数。

（3）所有菌落数均大于300，取稀释度最高的平均菌落数乘稀释倍数。

（4）所有菌落数均小于30，取稀释度最低的平均菌落数乘稀释倍数。

（5）所有菌落数均不在30～300之间，以最接近30或300的平均菌落数乘稀释倍数。菌落计数方法p207第16页，共21页，2023年，2月20日，星期六第17页，共21页，2023年，2月20日，星期六实验报告

计算土壤样品的细菌总数和产胞外淀粉酶的菌落数观察混合菌悬液的划线分离情况，并描述两种菌的菌落形态特征第18页，共21页，2023年，2月20日，星期六思考题1、如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养物？请写出实验的主要步骤。P74(1)2、如果一项科学研究内容需从自然界中筛选到能产高温蛋白酶的菌株，你将如何完成？请写出简明实验方案。P74(4)

第19页，共21页，2023年，2月20日，星期六上次实验习题解答1、为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行效正？P48(1)

进行显微测量时，主要是利用效正后的目镜测微尺对物象进行测量。而物镜或目镜的实际放大倍数与标注的可能有误差，因此，更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行效正。

第20页，共21页，2023年，2月20日，星期六2、某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1-2中可行的检测方法。①首先将干