实验四 大肠杆菌发酵培养基的优化

实验四大肠杆菌发酵培养基的优化第1页，共25页，2023年，2月20日，星期六实验目的1.掌握发酵培养基的配制方法2.熟悉用正交试验优化发酵培养基的方法3.学习比浊法测定发酵液菌浓的方法第2页，共25页，2023年，2月20日，星期六实验原理1.确定培养基的基本组成2.确定所用原材料的种类3.确定所用原材料的浓度配比关系一、培养基的配制方法第3页，共25页，2023年，2月20日，星期六1.单因素法2.正交试验法3.均匀试验设计二、培养基优化方法（原材料种类和浓度配比优化）第4页，共25页，2023年，2月20日，星期六1.概念利用已经设计好的表格--正交表--来安排试验并进行数据分析的一种方法。它是从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。三、正交试验法第5页，共25页，2023年，2月20日，星期六2.基本工具——正交表记号：Ln（tm）L：正交表的符号n：表的行数（可安排试验的次数）t：表中的字码数（水平数）m：表的列数（最多可安排因素个数）L8(27)L9(34)L16(45)第6页，共25页，2023年，2月20日，星期六第7页，共25页，2023年，2月20日，星期六3.正交表的特点试验点分布均匀、整齐可比任何一列中各字码（水平）都出现，且出现的次数相等任何两列中各横行组成的数字对，包含着所有可能的数字对，且各种数字对出现的次数相等第8页，共25页，2023年，2月20日，星期六4.实验的基本步骤（1）明确任务确定指标（2）制定因素水平表1）确定因素（A、B、C……）2）选择因素的变化范围3）确定因素水平数4）制定因素水平表因素水平A淀粉/%B黄豆饼粉/%C蛋白胨/%1530.22750.43970.6第9页，共25页，2023年，2月20日，星期六（3）设计试验方案1）选择正交表2）表头设计（不混杂）3）列出试验方案4）进行实验因素实验号ABC结果123456789111222333123123123123312231第10页，共25页，2023年，2月20日，星期六因素实验号ABC结果123456789111222333123123123123312231X1X2X3X4X5X6X7X8X9（4）分析试验结果1）方法一：直接比较第11页，共25页，2023年，2月20日，星期六直观分析法是通过对每一因素的平均极差来分析问题。所谓极差就是平均效果中最大值和最小值的差。有了极差，就可以找到影响指标的主要因素，并可以帮助我们找到最佳因素水平组合。极差的大小反应在所选择的因素水平范围内该因素对测定结果影响的程度。极差大的因素在所选择的因素水平范围内对测定结果的影响最大，在测试过程中必须严格控制。2）方法二直观分析第12页，共25页，2023年，2月20日，星期六因素实验号ABC结果123456789111222333123123123123312231X1X2X3X4X5X6X7X8X9k1k2k3

(X1+X2+X3)/3(X4+X5+X6)/3(X7+X8+X9)/3(X1+X4+X7)/3(X2+X5+X8)/3(X3+X6+X9)/3(X1+X5+X9)/3(X2+X6+X7)/3(X3+X4+X8)/3极差K最大-K最小K最大-K最小K最大-K最小A：首先计算各因素每个水平的平均效果和极差。第13页，共25页，2023年，2月20日，星期六B：然后对计算结果进行分析，分析各因素的主次和影响趋势，找到最优试验方案。

比较RA

、RB、RC值，R值越大的因素，影响越大，控制要越严格，R值越小的因素，影响越小。对每一个因素，选择K值最大的水平为最佳条件。如对于因素A淀粉，若k2>K1>k3，即k2最大，根据因素水平表中的设计，其水平为7%。表明7%为最佳的淀粉浓度。对于因素B，k2最大，对于因素C，k3最大。则实验的最佳实验条件为：A2B2C3，即最佳实验条件为：淀粉为7%，黄豆饼粉5%，蛋白胨0.6%第14页，共25页，2023年，2月20日，星期六

若某一因素k3或者k1最大，则说明所选择的该因素的水平范围不合适，如：对于因素C，k3最大，说明因素水平表中所设计的最高水平0.6%不一定为最佳。如果该因素的R值较大，影响较显著，则必须进行重复实验或对照实验。其中对照实验条件应为：试验1：A2B2C3试验2：A2B2C4

C4应大于C3对照两者的结果，若试验1结果值大于试验2，则试验1条件即为最优化条件。若试验2结果值大于试验1，则应再改变因素C的水平，继续做对照实验，直至达最佳结果。第15页，共25页，2023年，2月20日，星期六细菌培养物在生长过程中，由于原生质含量的增加，会引起培养物混浊度的增高。细菌悬液的混浊度和透光度成反比、与光密度成正比，透光度或光密度可借助光电比浊计精确测出，因此可用光电比浊计测定细胞悬液的光密度（OD值），表示该菌在特定实验条件下的细菌相对数目，进而反映出其相对生长量。四、比浊法测定发酵液菌浓第16页，共25页，2023年，2月20日，星期六本实验以菌体生物量为指标，用四因素三水平的正交试验确定大肠杆菌的最优培养基。第17页，共25页，2023年，2月20日，星期六实验步骤一、培养基的配制表1正交试验表设计因素水平A酵母浸膏/%B蛋白胨/%C氯化钠/%DpH10.20.50.5620.511730.81.51.581.将酵母浸膏、蛋白胨、氯化钠作为培养基的主要影响因素，每一因素设定3个水平，进行三因素三水平的正交试验，试验设计如表1第18页，共25页，2023年，2月20日，星期六因素A酵母浸膏/%B蛋白胨/%C氯化钠/%DpHOD值实验11(0.2)1(0.5)1(0.2)1(6)实验21(0.2)2(1)2(0.5)2(7)实验31(0.2)3(1.5)3(0.8)3(8)实验42(0.5)1(0.5)2(0.5)3(8)实验52(0.5)2(1)3(0.8)1(6)实验62(0.5)3(1.5)1(0.2)2(7)实验73(0.8)1(0.5)3(0.8)2(7)实验83(0.8)2(1)1(0.2)3(8)实验93(0.8)3(1.5)2(0.5)1(6)表2正交表实验方案2.按表2配制9组培养基入100ml锥形瓶中，每瓶25ml，（可四小组分工合作）第19页，共25页，2023年，2月20日，星期六锥形瓶培养基：标记，加棉塞、报纸包扎。1ml移液管2支121℃，灭菌20min二、灭菌第20页，共25页，2023年，2月20日，星期六将菌种（教师预先培养好）摇匀后用无菌移液管吸取0.5ml悬液，接到每一组培养基中（接种量要完全一样）三、接种第21页，共25页，2023年，2月20日，星期六将三角瓶置于恒温摇床中，37℃，120rpm培养12h四、发酵第22页，共25页，2023年，2月20日，星期六五、比浊法测定各发酵液OD值取下摇瓶，以空白培养基为对照，于600nm处测定各摇瓶中发酵液的OD值，填入表中。注意：如果OD值过大，需将发酵液作一定稀释后再测定。第23页，共25页，2023年，2月20日，星期六实验结果填写正交实验表，分析数据，确定最优培养基配方第24页，共25页，2023年，2月20日，星期六因素A酵母浸膏/%B蛋白胨/%C氯化钠/%DpHOD值实验11(0.2)1(0.5)1(0.2)1(6)实验21(0.2)2(1)2(0.5)2(7)实验31(0.2)3(1.5)3(0.8)3(8)实验42(0.5)1(0.5)2(0.5)3(8)