糖化血红蛋白实验室检测基础及标准化进展

糖化血红蛋白实验室检测基础及标准化进展第1页/共89页HbA1c实验室检测第2页/共89页糖化血红蛋白的发展历史概述1958年，Allen报告，在离子交换层析上的的人血红蛋白可以分离出三个小组分，他们较HbA的负电荷更强，被命名为HbA1a,HbA1b,HbA1c。1969年Rahbar使用琼脂电泳，报告糖尿病患者的这些小血红蛋白组升高1970年代中期，弄清楚了是葡萄糖对血红蛋白HbA的非遗传修饰，产生了HbA1c1980年中期，GHb(糖化血红蛋白）检测被广泛应用，但当时结果可比性很差DCCT研究发表后，1996年起，美国正式启动了NGSP项目，推动糖化血红蛋白检测的标准化。2010年达成了全球标准化共识第3页/共89页HbHbA0HbA1HbA1aHbA1bHbA1cHbA(ßß)HbA2()HbF()95%<2%1-3.5%成人血红蛋白分三种，HbA为主要成人Hb非糖化Hb糖化Hb6-8%87-89%血红蛋白胎儿血红蛋白HbF在胎儿及出生6个月以内的新生儿体内为高浓度，6个月后基本降为成人水平糖化和非糖化的血红蛋白<1%<1%4%-6%HbA1a:ß链NH2端与其它糖成分结合的产物HbA1b:HbA1c进一步代谢的产物HbA1c:ß链NH2端与葡萄糖结合的产物第4页/共89页HbA1c是血红蛋白HbA的糖基化产物葡萄糖与血红蛋白HbA发生糖化反应两步反应：

先快速生成不稳定A1c,

后缓慢生成稳定的A1c。血红蛋白HbA糖化后，负

电荷会增加第5页/共89页HbA1c的主要检测方法基于电荷离子交换高压液相色谱法（HPLC）电泳法毛细管电泳基于结构硼酸亲和层析法酶法免疫法第6页/共89页各检测方法的分析物HbA(a2b2)HbA1HbA0HbA1aHbA1bHbA1c非糖化成分糖化成分离子交换色谱和免疫法检测物硼酸亲和色谱检测物第7页/共89页离子交换HPLC检测原理A:患者红细胞裂解物被注入到带有负电荷的分析柱中B,C:因为与带负电荷树脂间的离子相互作用，带正电荷的血红蛋白分子的移动速度比带负电荷的慢D:因为HbA1c比HbA0所带负电荷强，所以首先被洗脱.E:离子交换HPLC方法能分离并鉴定其他种类Hb及一些血红蛋白变异体，在色谱图上将出现相应的分离峰PathologyConsultationonHbA1cMethodsandInterferences,AmJClinPathol2014;141:5-16第8页/共89页国内上市的IE-HPLC方法的主要厂家平台厂家仪器Bio-RadVARIANTIITurboHbA1cKit-1.0/2.0VARIANTIIHbA1cProgramD-10HemoglobinA1cProgramTosohG7G8GXArkray81608180上海惠中MQ2000MQ2000PT第9页/共89页国内上市的LPLC方法的主要厂家平台厂家仪器深圳普门GH-900HbA1cAnalyzerDrewScientificDrewDS5Diastat江苏奥迪康AC660第10页/共89页毛细管电泳法的检测原理毛细管电泳分离血红蛋白组分是基于电荷等决定的电泳迁移率一种高压电源产生电场，使分子通过毛细管从阳极迁移到阴极。患者红细胞裂解液中带正电荷的血红蛋白组分将首先被检测到，其次是中性物质，最后由带负电荷的血红蛋白组份。电泳图谱显示HbA1c与HBA0分离。PathologyConsultationonHbA1cMethodsandInterferences,AmJClinPathol2014;141:5-16第11页/共89页Sebia糖化产品概览Capillarys2withFlexPiercing是Sebia糖化系统中的唯一有CFDA证的，8个通道同时使用时，1.6分钟/检测。全国总代理-广州执信价格：30元/测试（到代理商）今年在全国主要地区推广力度强，特别在南方两广地区是该公司传统重要市场MiniCAPCapillary2Capillary2withFlexPiercing*(Capillary2withFlexPiercing为Capillary2的升级版，只多了可采原始样本管，其他参数一致)withFlex第12页/共89页硼酸亲和色谱法的原理A：患者的红细胞裂解液注入到含有结合了硼酸基团的树脂的分析柱中。B：在pH高于8.0时，血红蛋白被糖化后产生一个特殊的顺式二糖醇基团与硼酸基团发生反应C：糖化的血红蛋白被绑定在分析柱中，而非糖化的血红蛋白组分直接流出D酸性缓冲液被使用，使得糖化的血红蛋白从分析柱内释放出来图E是一种简化的色谱图（蓝线），显示了非糖化和糖化血红蛋白组分的分离。PathologyConsultationonHbA1cMethodsandInterferences,AmJClinPathol2014;141:5-16第13页/共89页硼酸亲和色谱法特点硼酸亲和色谱法直接检测的是总糖化血红蛋白，报告结果是计算出来的HbA1c。硼酸亲和色谱法不能分离出血红蛋白变异体第14页/共89页国内上市的硼酸亲和色谱法的主要厂家平台厂家仪器PrimusHb9210PDQPlusUltra2Bio-RadIn2itAlereAfinionNycoCard第15页/共89页免疫分析法检测原理-抗原抗体反应A:在没有HbA1c时，polyhaptens（包含多个HbA1c表位的合成分子）与绑定在微粒上的抗HbA1c抗体反应，形成不溶性抗体-polyhapten复合物。这导致显著的光散射（浊度增加）B:患者红细胞裂解液中的HbA1c与抗HbA1c抗体结合，形成可溶性抗原抗体复合物，从而减少光散射（浊度降低）。通过比浊测定可检测出该样本中的HbA1c的量PathologyConsultationonHbA1cMethodsandInterferences,AmJClinPathol2014;141:5-16第16页/共89页酶法检测原理A：图示是糖化的HbA的β链的前8个氨基酸，

患者的红细胞裂解液在蛋白酶存在的情况下，

氨基酸和小段肽链被释放,包括HbA1c的氨基

酸末端糖化的缬氨酸B：糖化缬氨酸的酶促去糖化反应C：缬氨酸去糖化过程产生H2O2.H2O2的形成

可以用比色法测定.产生的信号与样本中的

HbA1c成正比PathologyConsultationonHbA1cMethodsandInterferences,AmJClinPathol2014;141:5-16第17页/共89页国内免疫分析法/酶法厂家仪器平台及试剂盒厂家仪器试剂盒RocheCobas生化系列机型糖化血红蛋白检测试剂盒(免疫比浊法)Tina-quant系列试剂盒Hitachi生化系列机型开放或罗氏试剂Siemens

Dimension等生化系列机型糖化血红蛋白测定试剂盒(免疫比浊法)ADVIA生化分析系统糖化血红蛋白A测定试剂盒(乳胶凝集法)DCAVantage（POCT）糖化血红蛋白检测试剂盒(免疫乳胶凝集抑制法)BeckmanAU生化系列机型糖化血红蛋白检测试剂盒(比色法)Beckman其他生化系列AbbottARCHITECT生化仪系列糖化血红蛋白测定试剂盒(化学发光微粒子免疫检测法)Randox(朗道）血红蛋白A1c检测试剂盒(乳胶增强免疫比浊法)德国胡曼糖化血红蛋白(HbA1c)测定试剂盒JEOLLtd（希森美康代理）糖化血红蛋白检测试剂盒(酶法)Sekisui（积水）Medical糖化血红蛋白检测试剂盒(酶法)AuditDiagnostics（北京欧迪代理）糖化血红蛋白测定试剂盒(直接法)国产厂商国产生化分析系统国产生化试剂第18页/共89页HbA1c的主要检测方法的特点方法原理优势挑战酶法使用特别作用于氨基酸末端糖化的缬氨酸的酶检测HbA1c不受变异体的分析干扰不能发现血红蛋白变异体免疫法使用针对糖化的β链氨基酸末端的抗体检测HbA1c在使用新一代的试剂盒时分析不受大多数常见变异体的干扰不能发现血红蛋白变异体，新一代的试剂盒依然会受到少见变异体的分析干扰硼酸亲和层析法糖化的血红蛋白被绑定在硼酸基团树脂时，非糖化的血红蛋白组分直接流出分析柱最小的Hb变异体分析干扰检测的是总糖化血红蛋白，而不是HbA1c,不能发现血红蛋白变异体离子交换HPLC基于电荷分离血红蛋白组分能够发现常见的血红蛋白变异体变异体被共洗脱时易被干扰毛细管电泳法基于电荷分离血红蛋白组分能够发现血红蛋白变异体工作流程PathologyConsultationonHbA1cMethodsandInterferences,AmJClinPathol2014;141:5-16第19页/共89页糖化血红蛋白的重要地位在第59届美国糖尿病学会年会上，HbA1c监测的重大影响与胰岛素问世相提并论，并将前者作为血糖控制的金标准2014年ADA指南推荐：对于治疗达标（血糖控制稳定）的患者，每年应该至少进行两次HbA1c检测。对更改治疗方案或血糖控制未达标患者，应每年进行四次HbA1c检测在临床上，无论用什么方法反映血糖的变化，最终都要以HbA1c的变化作为最终评价一种药物或一个治疗方案在血糖控制上是否有效的指标DiabetesCareVolume37,Supplement1,January2014“中国糖化血红蛋白教育计划”教材第20页/共89页2010年ADA率先正式推荐HbA1c诊断DM,推荐原因之一就是在美国HbA1c已高度标准化2011年WHO推荐有条件的地方采用HbA1c诊断糖尿病中国？？？HbA1c检测用于糖尿病筛查诊断的全球现状HbA1c有早期提示的价值，可作为糖尿病的诊断指标第21页/共89页最新2013版中国2型糖尿病防治指南HbA1c临床应用推荐鉴于HbA1c检测在我国尚不普遍，检测方法的标准化程度不高，测定HbA1c的仪器和质量控制尚不能符合目前糖尿病的诊断的要求。本指南仍不推荐在我国采用HbA1c诊断糖尿病。但对于采用标准化检测方法，并有严格质量控制，正常参考值在4.0%~6.0%的医院，HbA1c≥6.5%可作为诊断糖尿病的参考。中华糖尿病杂志2014年7月第6卷第7期第22页/共89页HbA1c用于糖尿病监测和筛查诊断的必备条件实验室指标参与临床评估、作为诊断标准，除了检测指标固有的先天优势外，具有符合要求的准确性精密度（CV）正确度（Bias）第23页/共89页HbA1c分析中的CV对临床判断的影响0.5%HbA1c是一个“临床上显著变化”的指标CV%6.0%A1C6.5%A1C7.0%A1C25.76-6.246.24-6.766.72-7.2835.64-6.366.11-6.896.58-7.4255.4-6.65.85–7.156.3–7.7不同室内CV对A1C分析的影响（95%的可信区间）正常人和病人无法区分血糖控制好坏无法区分第24页/共89页HbA1c分析中偏倚大对临床判断的影响Copyright©2010AmericanAssociationforClinicalChemistry小的偏倚将导致很大人群的误诊第25页/共89页标准化的目的和意义目的:实现检验结果的可比性--保证检验质量意义（益处）可以建立起普遍接受（可用）的参考区间可以合并分析、比较不同医学中心的研究资料促进医学研究和研究成果的转化能够有效地应用循证医学和检验医学实践指南第26页/共89页HbA1c实验室检测的标准化进展第27页/共89页全球范围内主要标准化日本标准化瑞典标准化中国标准化之路第28页/共89页1993年CAP糖化血红蛋白调查结果HbA1cTotalGHBHbA1在DCCT和UKPDS结果发表之前，美国有800个试验室在做A1C检测，CAP实验调查显示在不同的实验室，用不同的检测方法得出的A1C结果存有巨大的差异。第29页/共89页从DCCT认识标准化在组织进行DCCT的临床试验中，考虑到当时检测“糖化血红蛋白”的方法繁多、相互间可比性差的问题。为了确保临床试验结果的可靠性，整个试验期间所有检测糖化血红蛋白的样品全部在两个实验室内检测，并强调仅以一个实验室为准，另一个实验室的结果必须校准至与该实验室一致。这就是在当时没有参考物质和参考方法的前提下采取的标准化，确保了试验成功！第30页/共89页DCCT成果的推广为了将DCCT的成果用于临床为糖尿病病人服务，就必须要求美国的各实验室的糖化血红蛋白结果和DCCT值具有可比性；因为如果仅确定任何方法的糖化血红蛋白值是否在实验室的“正常范围”，是没有意义的。需要更精确地了解：这个检测值和DCCT值的关系是什么？因为只有DCCT结果直接和平均血糖及并发症风险有关。第31页/共89页国家糖化血红蛋白标准化计划(NGSP)美国自1996年开始开展国家糖化血红蛋白标准化计划(NGSP)开展NGSP的目的：1.糖化血红蛋白检测项目实现标准化

2.以使各临床试验室的检测结果与DCCT的报告结果具有可比性第32页/共89页NGSP网络PRLPRLNGSP实验室网络SRLSRLSRLNGSP监控网络（月度）SRLCPRL指导委员会执行核心SRLSRLSRLSRL第33页/共89页NGSP程序NGSP监控

网络（月度）厂商和实验室认证（I级和II级）校准品1新鲜血(精密度与偏差)认证2新鲜血能力比对测试3新鲜血常规临床实验室第34页/共89页NGSP对厂家方法的认证NGSP要求：生产厂家有责任保证其它批号的试剂、校准品、质控品、（色谱柱）所测结果与认证结果保持一致认证标准：逐步提高认证有效期：1年/docs/methods.pdf第35页/共89页第36页/共89页NGSP对实验室的认证由NGSP的二级参考实验室来对实验室进行认证工作得到认证的实验室所测结果是可靠的认证标准：逐步提高认证有效期：1年http:///docs/labs.pdf第37页/共89页38第38页/共89页CAP项目：能力比对测试美国病理家学会（CAP）2007年开始使用基于NGSP设定的目标值作精密度等级(+CV)，要求逐年严格2007±152008±122009±102010±82011±72012±72013/2014±6/CAP/CAP09b.pdf,andMeetingminutesfromNGSP/IFCCManufacturersForum,AACCAtlanta2011第39页/共89页2014年CAP结果第40页/共89页NGSP标准化成果2013年调查显示3000多家CAP实验室间，A1C的检测结果已经有效的标准化第41页/共89页IFCC国际标准化1995年IFCC成立HbA1c标准化工作组，旨在建立具有高计量学水准的参考系统，实现HbA1c测定的全球可比性明确定义HbA1c葡萄糖与血红蛋白β链N末端缬氨酸残基稳定的化合物，全称为：血红蛋白β链（血液）-N-（1-脱氧果糖-1-基）血红蛋白β链制备纯度标准物质建立一个特异测定HbA1c的参考方法建立国际参考实验室网络完成了与指定比对方法的比较工作第42页/共89页

IFCC参考方法的原理谷氨酸内切酶HbA1c六肽HbA0六肽糖基化的β链N末端的六肽片段非糖基化的β链N末端的六肽片段第43页/共89页IFCC参考方法的流程溶血液制备酶解HPLC串联毛细管电泳HPLC串联质谱高特异性和准确性的计量结果第44页/共89页IFCCHbA1cStandardization第45页/共89页IFCC参考方法的局限性特异测定HbA1cIFCC测定结果低于目前商业方法（NGSP）结果耗时、费用高，目前不适合临床实验室第46页/共89页其他国家、地区的标准化日本标准化参考方法：KO500（离子交换HPLC法）瑞典标准化参考方法：MonoS（强氧离子交换树脂甲基磺酸盐HPLC法）各标准化组织在相应区域内实现了HbA1c测定结果的一致性，但采用参考方法特异性不同，不同国家、地区间结果不具可比性。第47页/共89页不同国家值之间的差异JDS/JSCC=0.927*IFCC+1.73NGSP=0.915*IFCC+2.15Sweden=0.989*IFCC+0.88IFCC%HbA1cJDS%HbA1c2.09.610.811.6NGSP%HbA1c4681012第48页/共89页改变数值对患者的影响改变HbA1c报告的数值范围的心理影响将对血糖控制产生影响RagnarHanas,DiabetesCare2002,25:2110-2111第49页/共89页对病人的心理影响RagnarHanas,DiabetesCare2002,25:2110-2111糖化血红蛋白的百分比数字表示患者实际数字.虚线表示糖化血红蛋白值基于参考水平变化的预期变化调整为较高的DCCT检测校准后，患者的HbA1c结果降低，说明血糖控制显著改善当调整回瑞典检测校准后，患者的HbA1c结果升高，血糖控制恶化第50页/共89页如何看待不同结果第51页/共89页糖化血红蛋白的全球标准化之路ADA/EASD/IDF的HbA1c工作组，建立于2004年，目的是使HbA1c报告一致。2007年5月4日在意大利米兰召集了讨论审核，并发布了国际协调申明2010年正式公布了HbA1c全球标准化

测定共识第52页/共89页2010年全球标准化共识内容HbA1c的检测必须在世界范围内标准化，包括参照系统和数值报告。IFCC的参考系统是唯一能够满足标准化要求的方法。将来HbA1c同时以IFCC单位(mmol/mol)以及衍生的NGSP单位(%)报告，使用IFCC-NGSP换算公式进行转换。第53页/共89页NGSP与IFCC关于报告单位在美国，日本和中国依然报告%HbA1cNGSP欧洲和其他国家接受了IFCCmmol/molNGSP与IFCC关于报告单位的争论仍未结束第54页/共89页中国HbA1c产品的标准化认证现状市面常见的HPLC方法获得NGSP认证；多数免疫方法获得NGSP认证；部分POCT、酶法获得NGSP认证；国产生化试剂基本无NGSP认证第55页/共89页中国HbA1c标准化之路EQA（NCCL及各地临检中心）NGSP认证及国内一致性项目

参考系统建立及应用IFCC参考实验室网络糖化血红蛋白教育计划-CHEP糖化血红蛋白标准化计划-CHSP(CNSP)制定中国糖化血红蛋白相关行业标准第56页/共89页国内目前主要EQA项目卫生部临检中心（NCCL）HbA1c室间质量评价计划（EQA）

每年一次，5个样本，冰冻新鲜全血各省临检中心HbA1c室间评价计划（EQA）

各省情况不一美国病理协会(CAP)HbA1c室间质评计划（CAPGH2survey)

全年测定2次，每次下发3个新鲜全血样本厂家的HbA1c室间质量评价服务（EQAS）Bio-Rad公司EQAS第57页/共89页NGSP实验室认证及中国NGSP认证实验室情况认证类型#样品比对偏差标准监测（是/否）监测方案厂商（Manufacturer）4040样本中有37个结果在±6%否—I级认证实验室（LevelIlab）4040样本中有38个结果在±6%是10个样本（季度）II级认证实验室（LevelIILab）4040样本中有37个结果在±6%否—NGSP实验室网络开展针对全球临床实验室的认证国内与2005年开始与NGSP的联系截至2014年6月，全球NGSP认证实验室共有147家，其中中国NGSP认证实验室共有28家/critsumm.asp第58页/共89页国内区域性的糖化血红蛋白一致性项目上海糖化一致性项目(SHGHP)目的是提高上海地区糖化检测质量。方法是参考NGSP的全血样本比对方法。三家核心参考实验室均为NGSP一级认证实验室目前有近百家实验室参与，以上海为主，已有相当数量各地实验室参加南京地区糖化血红蛋白一致性项目江苏？西安？四川？新疆？……第59页/共89页参考系统建立IFCC参考方法建立NCCL：HPLC-LC/MS/MS上海检验中心：HPLC-CE中国计量科学研究院：同位素稀释质谱法北京市临床检验中心：LC/MS/MS参考物质第60页/共89页参考系统应用卫生部临检中心HbA1c正确度验证计划始于2012年，参加实验室87家；2013年参加实验室120家；

全年活动1次，发放2个样本，为新鲜冰冻全血

靶值确定方法采用IFCC推荐参考方法第61页/共89页加入IFCC参考实验室网络上海市临床检验中心NCCL北京市临床检验中心……第62页/共89页中国糖化血红蛋教育计划（CHEP)项目发起人：纪立农教授宁光教授陈文祥主任主办单位：中华医学会科普部协办单位：中国医院协会临床检验管理专业委员会“中国糖化血红蛋白教育计划”是国家科技支撑计划项目“公众健康普及技术筛选与评价研究”的分课题“常见多发病防治技术要点筛选和普及研究”中的重要部分中国糖化血红蛋白教育计划第63页/共89页糖化血红蛋白标准化计划-CHSP(CNSP)……第64页/共89页IFCC实验室认证疑云？全球均无IFCC

临床实验室认证中国哪家IFCC参考实验室执行？如何收费？……第65页/共89页中国HbA1c相关行业标准SFDA行业标准《糖化血红蛋白分析仪》-针对厂家在中国上市中国糖化血红蛋白实验室检测指南

-针对临床实验室第66页/共89页HbA1c实验室检测和临床应用最新指南第67页/共89页中国糖化血红蛋白实验室检测指南目的：

为提高我国HbA1c检测质量，适应HbA1c临床应用发展的需要，

更科学合理有效地运用糖化血红蛋白，

充分发挥其作用制定机构：

卫生部临床检验中心

国家食品药品监督管理总局医疗器械检验所

糖尿病专家1糖化血红蛋白实验室检测指南中国糖尿病杂志2013年8月第21卷第8期第68页/共89页中国糖化血红蛋白实验室检测指南解读对分析系统的要求分析系统性能指标要求对色谱柱的要求对异常结果处理的建议对结果报告的要求实验室保证HbA1c测定结果质量的4个环节第69页/共89页1.分析系统的要求测定方法要求溯源到IFCC参考方法，如NGSP认证方法实验室要知晓所选分析系统可能存在的干扰因素POCT方法的精确性不能满足临床要求，目前不能用

于糖尿病的诊断第70页/共89页2.分析系统性能指标要求报告结果：以“HbA1c”或相当于“HbA1c”报告结果，因为只有这一个分析项目才有评估并发症发生的优良数据库。精密度：室内CV<3%（以小于2%为宜）；HbA1c测定质量目标：<0.5%HbA1c注意：没有直接的证据显示其它的检测指标与糖尿病长期并发症风险有关(例如：总糖化血红蛋白、果糖胺或糖化血清蛋白)第71页/共89页3.色谱柱的要求实验室应知晓本室所使用色谱柱可检测样品的数量达到检测数量限应及时更换，不可超量使用不同方法的色谱柱可检测样品数量不同第72页/共89页4.异常结果处理HbA1c检测结果低于4%或大于15%的样品应进行复查，并与临床医生沟通对测定结果与临床表现不符的样品应进行进一步检测(需在NGSP认证的方法下使用)第73页/共89页5.结果报告NGSP单位（%）+IFCC单位（mmol/mol）NGSP与IFCC转换公式(NGSP=[0.0915*IFCC]+2.152)以%为单位的结果后1个小数点报告如临床需要，需提供方法学名称第74页/共89页6实验室保证HbA1c测定结果质量的4个环节1选择可靠的分析系统2规范化使用分析系统3知晓HbA1c检测的干扰因素4参加室间质量评价第75页/共89页HbA1c的测定结果受妊娠影响HbA1c是反映血糖控制平均水平的指标。妊娠妇女血容量增加，Hb降低，因此其HbA1c水平较非妊娠妇女低，不能真实反应平均血糖水平。RadderJKetal.NethJMed2005Jul-Aug,63(7):256-259.PartidaHernándezGetal.GinecolObstetMex2000Oct,68:420-424.第76页/共89页进展迅速的T1DM有一些临床少见的情况，如进展迅速的1型糖尿病，这时HbA1c就可能没法“赶上”急性血糖变化的速度，因而不能反应真实的平均血糖水平。第77页/共89页药物维生素C和E可抑制血红蛋白的糖基化，长期大剂量服用可以使HbA1c测定结果假性降低。长期大剂量服用乙酰水杨酸盐嗜酒会导致血红蛋白乙酰化，使HbA1c测定结果假性升高长期使用慢性麻醉剂，可使HbA1c测定结果假性升高第78页/共89页尿毒症(氨基甲酰化血红蛋白）对HbA1c测定影响第79页/共89页HbA1c的测定结果受RBC寿命的影响任何改变红细胞寿命的因素都将导致HbA1c结果不准确RBC寿命降低，

HbA1c降低：溶血性贫血、大量的失血和输血HbS和HbC（RBC寿命缩短为~29天）。RBC寿命增加，HbA1c升高：铁缺乏，脾切除术后、再生障碍性贫血时，红细胞清除障碍或网织红细胞生成减少。

KutterDetal.ClinLab2006,52(9-10):477-481.DaaeLNetal.ClinChem1999Apr,45(4):569.WangYe