二代测序NGS培训班课件 1沈立松 2017二代测序在肿瘤诊断中的应用 171012

沈立松

上海交通大学医学院附属新华医院

2017年10月

高通量测序及其在肿瘤诊断中的应用报告提纲一、主流高通量测序技术平台简介二、高通量测序技术临床应用基础三、高通量测序与肿瘤个体化诊治四、思考与挑战一、主流高通量测序技术平台简介测序的科学与技术基础2005年，高通量测序技术（Nextgenerationsequeincing,NGS）也称为二代测序技术、新一代测序技术。1977年，DNA测序技术（1980年诺贝尔化学奖）MaxamGilbert化学降解法双脱氧核苷酸末端终止法（Sanger测序）Sanger测序是人类基因组计划的主要技术1953年，DNA双螺旋（1962年诺贝尔生理医学奖）MolecularStructureofNucleicAcids:AStructureforDeoxyriboseNucleicAcid.

Nature171(April25,1953):737-738WalterGilbertUSFrederickSanger

UKFrancisCrickUKJamesWatson

US测序技术平台的发展现状一代测序二代测序2.5代测序

三代测序

SangerLife/ABI310测序仪IlluminaSolexa技术454/Roche测序仪(退市)ABI/LifeTechnologiesSolid（退市）LifeIonTorrent半导体测序技术HelicosHeliscope测序仪PacificBiosciences测序仪OxfordNanopore纳米孔技术LuthraR,

ChenH,

Roy-ChowdhuriS,

etal.Cancers(Basel).2015:2023-36高通量测序法应用全基因组测序外显子组捕获测序转录组测序小RNA测序表观基因组分析应用高通量测序的实际检测灵敏度取决于最终测序深度二、高通量测序肿瘤临床应用基础肿瘤的高发病率和死亡率前十大肿瘤发病占肿瘤整体发病比例76.39%前十大肿瘤死亡占肿瘤整体发病比例84.27%*每10万人发病人数；**每10万人死亡人数发病率*每年新发4,292,000人死亡率**每年死亡2,814,000人肺癌，54人胃癌，36人结直肠癌，29人肝癌，29人食管癌，22人乳腺癌，21人胰腺癌，7人淋巴癌，7人膀胱癌，7人甲状腺癌，7人肺癌，46人肝癌，26人胃癌，26人食管癌，17人结直肠癌，14人胰腺癌，7人乳腺癌，5人白血病，4人脑癌，4人淋巴癌，4人ChenW,ZhengR,BaadePD,etal..CACancerJClin,2016Thisisamapfor22cancerregistries(datafrom2000to2011)Thisisamapfor72cancerregistries(datafrom2009to2011)突变增殖转移扩散肿瘤在个体和群体内的异质性EdwardJ.FoxandLawrenceA.Loeb.Nature.2014,512(7513):143–144个体的异质性不同肿瘤细胞类型的异质性同一肿瘤细胞内的异质性发生的区域的异质性（空间）原发和次生的异质性（时间）不同突变位点的异质性（基因）现代肿瘤治疗理念的转变美国癌症研究学会（AmericanAssociationforCancerResearch，AACR）Meeting,2014同癌异治（UmbrellaTrial）异癌同治（BasketTrial）ZardavasD,Piccart-GebhartM.ASCO.AmericanSocietyofClinicalOncology.2015:e183-90HymanDM,SolitDB,ArcilaME,.DrugDiscovToday.2015.pii:S1359-6446(15)00321-9带有相同基因靶点的不同肿瘤给予相同治疗例如：研究显示，维罗非尼（Vemurafenib）对BRAFV600突变的黑色素瘤和非黑色素瘤均取得良好疗效含有不同基因的同一肿瘤采用不同的治疗例如：NCCN指南显示，对于乳腺癌，HR+建议服用依维莫司（Everolimus）；HR-建议服用托瑞米芬（Toremifene）肿瘤治疗的个体化癌症基因组图谱项目（TCGA）/TCGA计划试图采用大规模基因组测序，绘制肿瘤基因组变异图谱，并进行系统分析，找到所有致癌和抑癌基因的微小变异，了解癌细胞发生发展机制，在此基础上获得新的肿瘤诊断和治疗方法，可以勾画出整个新型“预防癌症策略”。TCGA是HGP完成后更大型的高通量测序应用。癌症基因组图谱（TheCancerGenomeAtlas,TCGA）计划是由美国国家癌症研究所和美国国家人类基因组研究所于2006年启动的大型研究。TCGA包含了来自16个国家150多位研究人员的科学贡献，表征了来自超过25种不同癌症的100,00份肿瘤。数据包括1000万个突变，到目前为止它们已经发表在TCGA研究网络的17种出版物上，并被数百篇论文引用。TCGA数据已被用来寻找新的突变，定义固有的肿瘤类型，确定泛癌症的异同，揭示耐药机制和收集肿瘤进化的证据。毫无疑问，我们现在可以以前所未有的细节来研究癌症，但是我们仍然还不能解释这种疾病的全貌并阐明其机制。ICGC与国际肿瘤基因组计划LedfordH.Nature.2010;464(7291):972-4

国际肿瘤基因组协作联盟(ICGC)于2007年成立并启动了全球范围肿瘤基因组研究工作。ICGC提出对50种癌症、总计25000例患者样本绘制体细胞基因突变谱。多个国家课题组已经阶段性地总结了特定癌症的数据并报道了研究成果,当前跨癌种的泛癌症基因组研究成为ICGC工作重点。我国科学家是ICGC创始成员之一，并组建了“中国肿瘤基因组研究协作组”(CCGC)，启动了中国肿瘤基因组研究重大项目。初期，中国负责破译胃癌的基因组序列，后又陆续对结直肠癌、食道癌、肝癌、鼻咽癌等14种肿瘤的驱动基因进行检测，为实现个体化医疗奠定基础。IGGC项目是TGCA完成后更大型的高通量测序应用。CCGC和ICGC研究工作将积极推动癌症基因组学向肿瘤生物学的转化研究，为肿瘤的个体化精准诊疗提供理论和技术支撑。/ICGC数据汇总胡学达,杨焕明,赫捷,吕有勇.科学通报.2015,60(9):792-804NGS临床应用规范和质量管理NGS测序的临床实验室标准（2013）测序成本不断下降成本快速下降，测序领域的超摩尔定律助推临床应用

第一次人类基因组测序耗时13年，成本30亿美元，到2008年11月，基因组测序仅需一两周，花费10万美元。到2015年，新一代仪器可将全基因组序列测序成本降到1000美元以下，成本不足第一代的百万分之一。而且随着技术进步，仍在不断下降（100美元？）。WetterstrandKA.Availableat:

/sequencingcosts.

January15,2016

摩尔定律戈登.摩尔（1965年,Intel）当价格不变时，集成电路上可容纳的晶体管数目，约每隔18个月增加1倍，性能也提升1倍。即每一美元所能买到的电脑性能将每隔18个月提升1倍。这一定律揭示了信息技术进步的速度DNA测序数据库的大小每18个月会增加10倍（NBB,2012）医学革命---精准医疗精准医学计划的基础大规模生物数据库（如人类基因组序列、肿瘤基因组序列）有效阐述疾病的手段（基因组学、蛋白质组学、代谢组学）分析数据的计算工具（生物信息学、大数据处理、云计算）精准肿瘤医学模式RoychowdhuryS,ChinnaiyanAM.CACancerJClin.2016;66(1):75-88三、高通量测序与肿瘤个体化诊治临床肿瘤个体化分子诊治应用临床肿瘤高通量测序检测分析策略RoychowdhuryS,ChinnaiyanAM.CACancerJClin.2016;66(1):75-88生殖系肿瘤突变检测（Germline）临床应用：检测多种肿瘤的患病风险；肿瘤基因组合检测（Cancerpanel）检测肿瘤基因型，判定家系成员患病风险（Exomesequencing）指导肿瘤个性化治疗（化疗药物选择）针对肿瘤基因外显子或SNP多态性位点NGS检测RellingMV,

EvansWE.Nature.2015;526(7573):343-50儿童癌症患者易感基因检测ZhangJ,etal.NEnglJMed.2015,373(24):2336-46儿童和青少年癌症的发病率和易感基因突变在很大程度上是未知的。关于这种突变的认识可提高对肿瘤发生的认识，指导患者治疗，使患者和家庭能够进行遗传咨询。对于种系突变的存在，研究人员分析了565个基因的DNA序列，其中包括60个与常染色体显性遗传性癌症易感综合征有关的基因。研究人员对1120例年龄小于20岁的肿瘤患者正常组织和肿瘤组织进行全基因组测序（595例）、全外显子组测序（456例）或两者都进行测序（69例）儿童癌症患者易感基因检测ZhangJ,etal.NEnglJMed.2015,373(24):2336-46结果发现95名儿童患者（8.5%）存在致病性或可能致病性基因突变。儿童癌症患者携带不少成年癌症的致病基因，如乳腺癌和卵巢癌（BRCA、PALB2）。这些基因是成年癌症的主要驱动者，目前还不清楚它们是不是也能造成儿童癌症。癌症相关基因对儿童的影响远超我们认知，本研究表明在绝大部分儿童癌症患者中家族史并不能预测出潜在的易感性综合症。高通量测序的胚系基因检测未来将大有可为。肺癌Lung结肠癌Colon黑色素瘤Melanoma胃癌Gastric卵巢癌OvarianEGFRKRASKRASBRAFBRAFKITKITPDGFRAAKT1PIK3CAAKT1PIK3CAGNAQKRASAKT1FGFR2AKT1ERBB2ALKPTENAPCPTENMAP2K1NRASPIK3CAp53PTENp53BRAFp53CTNNB1SRCPIK3CAPTENCTNNB1MAP2K1EGFRp53METNRASFBXW7METNRASIndustryGuidelinesEmergingandClinicalTrials肿瘤组织体细胞突变检测（Somatic）指导肿瘤分子分型和个体化治疗LawrenceMS,

StojanovP,

MermelCH,etc.Nature.2014,505(7484):495-501商品化泛肿瘤靶向高通量测序项目RoychowdhuryS,ChinnaiyanAM.CACancerJClin.2016;66(1):75-88基于组织的肿瘤体细胞突变检测局限性很多肿瘤患者无法进行活检或手术；穿刺受检者严重不适感；穿刺自身的临床风险；取材时间点受限，很难进行多次取样；肿瘤异质性；非侵袭性肿瘤检测NICT

（Non-invasivecancertesting）非侵袭性肿瘤检测（NICT）SpeicherMR,PantelK.Naturebiotechnology,2014;32(5):441-443循环肿瘤细胞(Circulatingtumorcells,CTCs)游离肿瘤DNA(CirculatingtumorDNA,ctDNA)目前看，ctDNA更适合做液态活检液态活检（LiquidBiopsy）循环肿瘤DNA（ctDNA）ctDNA：来自凋亡、坏死的肿瘤细胞或者肿瘤细胞的外泌体；主要以核小体的形式释放入血；含量约占循环游离DNA的1%，甚至0.01%NGS可检测ctDNA遗传学改变DNA序列改变：点突变，缺失等CNV、染色体重排、非整倍体甲基化改变DiazLAJr,

BardelliA.JClinOncol.2014;32(6):579-86外周血游离DNA检测优势指导用药均质标本作为无法获取组织标本的补充，无创取样后的检测结果指导临床用药实现实时动态监测和预测肿瘤耐药及