质粒复制的调控机制

质粒复制的调控机制第1页，共19页，2023年，2月20日，星期日主要内容质粒的自主??复制性质粒复制的调控机制质粒不相容性(inc,incompatibility)第2页，共19页，2023年，2月20日，星期日质粒(plasmid)质粒是能独立于寄主染色体而自主复制并被稳定遗传的一类核酸分子绝大多数的质粒是DNA型目前已知只有酵母杀伤质粒(killerplasmid)是RNA型绝大多数的天然DNA质粒为共价、闭合、环状的分子结构，即cccDNA(covalentlyclosecircularDNA

)质粒DNA的分子量范围：1-200kb第3页，共19页，2023年，2月20日，星期日一质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制,并赋予宿主细胞特定的遗传性状.质粒DNA的复制方式:主要有“θ”型复制和滚环复制根据在每个细胞中拷贝数的多寡，质粒可分为两大复制类型：①严紧型质粒(Stringentplasmid)②松弛型质粒(Relaxedplasmid)一种质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并不是绝对的，同一质粒在不同的宿主细胞中可能具有不同的复制型，这说明质粒的复制不仅受自身的制约，同时还受到宿主的控制，同宿主的状况有关。

第4页，共19页，2023年，2月20日，星期日质粒复制类型严紧型质粒(Stringentplasmid)

松弛型质粒(Relaxedplasmid)

拷贝数少(1～3个拷贝数)多(10～60个拷贝数)分子量较大较小复制方式随细菌染色体的复制同步进行，即只在细胞周期的一定阶段进行复制，当细胞染色体复制一次时质粒也只复制一次独立于细菌染色体而自主复制,即在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。控制系统单拷贝控制系统多拷贝控制系统常见质粒F质粒,

P1质粒

ColE1质粒(20～30)

;pBR322(16copies);pUC(30～50copies)

第5页，共19页，2023年，2月20日，星期日二质粒复制的调控机制

为与宿主稳定地共存并把代谢负担减至最低,质粒必须控制自身的复制。在一定的生长条件下、在一定的宿主菌中,某一质粒的拷贝数(N)通常是一定的。负调控模型质粒刚移入新宿主时,负调节因子的浓度可忽略不计,质粒能在短时间内达到正常拷贝数,然后通过增加或减少每细胞周期每质粒拷贝的复制率来调节细胞中的质粒拷贝数(N),使该菌群中各细胞的质粒拷贝数维持在平均值(Nav)附近的一个很小的波动范围内。上述控制机制是由质粒自编码的负控制系统通过调控复制起始率而实现的,其负控制元件就编码在质粒上。第6页，共19页，2023年，2月20日，星期日现在已知的复制控制方式主要有三类:⑴单一元件控制;⑵主、辅元件控制;⑶2种控制元件协同作用。依所用负控制元件的类型不同,质粒复制的控制系统主要有:⑴重复子结合调控(iteron-bindingregulation)⑵抑制物-靶位调控(ihibitor-targetregulation)①反义RNA单独控制②反义RNA与转录阻遏蛋白共同控制第7页，共19页，2023年，2月20日，星期日⒈重复子结合调控(iteron-bindingregulation)

在含重复子的质粒复制起点(ori)中,有一富AT区和多个重复序列(重复子),质粒编码的复制起始蛋白Rep能以有序的方式与重复子序列结合,起到控制质粒拷贝数的作用。

在上述模式中,Rep蛋白结合在复制起始区及其附近的重复序列上,对复制起始起着正调节作用,同时对其自身的表达起负调节作用。第8页，共19页，2023年，2月20日，星期日Regulationofplasmidcopynumberbyiterons:

Rep蛋白能以二体形式结合于启动子区,反式作用,对其合成进行自我调节;Rep蛋白对复制具有双向调控作用,且视它的胞内浓度而定,当胞内浓度低时起复制激活剂作用,胞内浓度高时则起抑制剂作用。“手铐”模型(“handcuffing”model)第9页，共19页，2023年，2月20日，星期日空间位阻模型空间位阻模型认为,决定质粒复制率的主要因素是重复子的浓度而不是Rep蛋白的表达水平。当质粒拷贝数较低时,Rep蛋白与重复子结合并饱和,促发复制起始;随着质粒拷贝数的增加,结合于某一起点重复子的Rep分子,开始与结合于另一起点重复子的Rep分子相互作用,并通过Rep-Rep相互作用把2个环状质粒分子偶联起来,形成“手铐”状的复合物,导致这2个重复子区域之间出现空间位阻而阻断复制的起始。在随后的细胞生长期间,这种质粒对也逐渐分离,使各质粒分子的复制起始潜力得以恢复。第10页，共19页，2023年，2月20日，星期日⒉抑制物-靶位调控

(ihibitor-targetregulation)在这一模式中,由质粒编码的抑制因子(反义RNA)结合在复制起始区的特定靶位点上,对复制起负调控作用。反义RNA:小RNA分子,长35～150nt,有1～4个茎-环(stem-loop),其序列与靶转录物5'端的一个区域互补,又称反转录RNA(countertranscribedRNA,ctRNA)反义RNA的作用方式主要有以下两种:⑴抑制引物RNA加工(以ColE1质粒为例来说明)⑵抑制前导肽翻译(以R1质粒为例来说明)

第11页，共19页，2023年，2月20日，星期日⑴抑制引物RNA加工ColE1质粒的复制起始由一长为700nt的转录物RNAⅡ(preprimer)引发。RNAⅡ由宿主RNA聚合酶合成,经构象变化后,与模板DNA在复制起始区附近偶联(coupling)形成RNAⅡ-DNA杂交物,RNaseH切割其中的RNA部分,产生游离的3‘-OH,再在DNA聚合酶Ⅰ的作用下,从这个游离的3’-OH开始DNA前导链的合成。3‘-OH的生成是复制起始的限速步骤,受反义RNA(RNAⅠ)调控。RNAⅠ序列与RNAⅡ的前108碱基序列完全互补,互补区结合可改变RNAⅡ下游效应位点的二级结构,使RNAⅡ的3’端不能与模板DNA偶联,RNaseH就不能对RNAⅡ进行加工,从而阻断引物的生成,抑制复制的起始。第12页，共19页，2023年，2月20日，星期日RegulationofplasmidcolE1copynumberbyantisenseRNA:

控制复制引物与模板的结合RNAⅠ的启动子是组成型的,故其数量与质粒拷贝数成正比,但不稳定。在ColE1中还有一个质粒编码的控制元件Rom蛋白(又称Rop蛋白),Rop蛋白是RNA结合蛋白,它能增强RNAⅠ与RNAⅡ的相互作用,稳定RNAⅠ-RNAⅡ复合物,因而能加强对复制的抑制作用,但在上述控制回路中只起辅助作用。第13页，共19页，2023年，2月20日，星期日⑵抑制前导肽翻译这种作用方式的例子是质粒R1,它的基本复制子含有可读框copB、tap和repA,分别编码转录阻遏蛋白CopB、前导肽TAP和起始必需蛋白RepA。tap和repA是翻译偶联的。RepA蛋白是复制的限速因子,以顺式作用,但不能重复使用,其复制控制在转录和翻译两个水平上进行。主控制元件是RNAⅠ,名为CopA,从repA-mRNA前导区的一段互补链转录而来,长约90nt。第14页，共19页，2023年，2月20日，星期日RegulationofplasmidR1copynumberbyantisenseRNA:

控制复制起始因子(RepA)与Ori结合,从而抑制其上游DnaA蛋白的结合,抑制复制起始转录水平调控:在repA基因上游有两个启动子,PO(组成型)和PA(调节型),分别转录产生RNA-CX和RNA-A,均可作为RepA的mRNA。此外在RNA-CX5’端还编码CopB蛋白,可抑制PA开始的转录。翻译水平调控:CopA可同RepA的mRNA5’端部分碱基序列互补结合,产生位阻效应阻碍了前导肽基因(tap)的翻译,进而抑制了RepA的合成(翻译偶联),影响质粒复制第15页，共19页，2023年，2月20日，星期日四质粒不相容性质粒不相容性(plasmidincompatibility

)指在没有选择压力的情况下，同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存的现象，也称为不亲和性(inc)。例如colE1衍生质粒，它们之间是互不相容的，也就是说，这些亲缘关系较近的不同质粒，当两种进入同一细胞后，必定有一种在细胞的增殖过程中，被逐渐排斥(稀释)掉。质粒的不相容性是质粒分类的重要标志。

彼此不相容的质粒属于同一个不亲和群(incompatiblitygroup)。而彼此能够共存的亲和质粒，则属于不同的不亲和群。不亲和群之间的质粒是相容的，而同一个不亲和群内的质粒是不相容的。第16页，共19页，2023年，2月20日，星期日质粒不相容性的原因

质粒的不相容性现象主要是与质粒的复制调控和分离(segregation)机制有关，不能在同一细胞中并存的质粒是因为他们共享一个或多个共同的复制因子或相同的分配系统。(对于单拷贝质粒???)当两种复制及调控机制毫不相干的质粒在同一个细胞中生存时,它们各自复制,再各自分配到不同的子细胞中,不会发生干扰。当两种复制及调控机制相关或相同的质粒在同一个细胞中生存时,质粒复制及调控机制就会把它们看做成同种质粒而将他们的拷贝数控制在一定的数目内。由于细胞时质粒在子细胞中分配不均匀的缘故,经过几十次的细胞分裂后,就会造成敏感质粒的分离丢失。第17页，共19页，2023年，2月20