感受态细胞的制备(DH5α大肠杆菌)

/感受态细胞的制备（DH５α）准备工作所有试剂、容器均需提前预冷。1、实验器械4℃离心机（５0ml离心管），３７℃恒温箱，37℃摇床,超净台（使用前需要紫外消毒15ｍin至少）;0.22μm的滤器2个(过滤灭菌TfB2种溶液)，10ｍl注射器2个；冰盒；高压灭菌的1．５ｍlEＰ管1盒,与离心机配套的5０ml离心管6个（高压灭菌）,高压灭菌的500ml锥形瓶2个,高压灭菌的100ｍl玻璃瓶2个，高压灭菌的1mｌ枪头和２00μｌ枪头各一盒.2、试剂配制（甘油特别难吸,用蓝枪头慢慢吸吧）①ＬB平板：单纯LＢ平板，加有amp或有kａna的（制板时需标注好类型，时间)。②SOB培养基(SuperOpｔｉmａlＢｒoｔｈ)③TfBⅠ：（１０0ml制备量）分别称取乙酸钾0．294ｇ,MnＣl20．9９g，ＫＣｌ0．146g，CaCｌ20.111g，置于２00ｍl烧杯中，加入15ml甘油和85mｌDDW，摇晃，使其全部溶解.然后在安全橱中用孔径为０．22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的１0０mｌ玻璃瓶中,4℃保存，使用前必须预冷。（装在５0mｌ离心管,封口4度保存）④ＴｆBⅡ（20ml制备量，每次现用现配,装在5０ｍl离心管)：分别称取MOＰS0．046g，CaCl２０.167g,KＣl0。015g,置于50mｌ烧杯中,加入３mｌ甘油和1７mlDDW，摇晃,使其全部溶解。然后在安全橱中用孔径为0。22μm的滤器过滤混合液，使用前必须预冷。终体积TFB1浓度1００ｍl2０0mｌ250mｌ1LKAcＫClCaCｌ2MｎCl2·4H2OGlｙceroｌ30ｍM1０0mM1０mＭ150ｍM15%0。249g0.14６g０.11１g0．99g15ml0.588g0。292g0．223g1.9８g30ml0．623ｇ0。365ｇ0.２78g2。475g3７。5ml２．4９g１。4６g1.11g９．9ｇ１50ml先用部分去离子水溶解，后定容至要求体积。用0。2M醋酸调pH值至5。８（非常关键）,用针式过滤器过滤除菌，4度保存。ＴFB２浓度20ｍｌ2０0mlＭOPSCaCｌ2ＫClGｌycerol10mＭ75mM10mM1５%0。０42g０。16４g0。015ｇ３ml０.42g1。64ｇ０．15g3０ml先用部分去离子水溶解，后定容至要求体积。用1ＭKＯH调pH值至６。5,用针式过滤器过滤除菌,放在冰上当天现配现用SOB培养基配制量1L配制方法１．配制250mＭKCl溶液。(50ml离心管分装）在９0ml的去离子水中溶解l．86ｇKCl后,定容至100ml。２.配制2MMgＣl2溶液。（50ｍl离心管分装）在90ml去离子水中溶解4.06gＭgCl26H２Ｏ后，定容至1００ml，高温高压灭菌。３.称取下列试剂,置于ｌL烧杯中.Tryｐtoｎｅ20gYｅａstExｔｒacｔ5ｇＮaCl０.5g4。加入约8０0ml的去离子水,充分搅拌溶解。5。量取10m12５0ｍMKCｌ溶液，加入到烧杯中。６.滴加NａOH小块,调节pH值至７．0。7.加入去离子水将培养基定容至lＬ。8．高温高压灭菌后，４℃保存.9。使用前加入5ml灭菌的２MＭgＣｌ2溶液。ＬＢ培养基配制量1L配制方法1．称取下列试剂，置于lL烧杯中。Trｙptonｅ１0ｇYｅastExｔrａcｔ5gNaCl１０g２．加入约80０ml的去离子水,充分搅拌溶解。3。滴加固体ＮaOＨ，调节pＨ值至7.０。4．加去离子水将培养基定容至１L.5高温高压灭菌后，４度保存。实验步骤1、第一天：下午３点取出－80°的感受态细胞ＤH5a，冰浴，用枪头沾一点(就可以带出很多细菌,剩余的不要了)，在50０ｕl的LB液体培养基中吹打（轻柔)，取50ul至另一个50０ul的LB中再稀释,取１０0ｕl涂板。3７度恒温箱培养过夜约1６h（具体时间观察单克隆，可以顺利挑菌就行）。第二天早上，观察是否长出单个菌落,菌落大小合适时，向2个无菌的摇菌管分别加入5ｍl高压过的SOＢ培养液，标注为对照管和DH5α管。从LB平板上挑取单个菌落加入ＤＨ5α管中,220rpm，3７℃，５h,OD55０达0．3，将５mlSOB倒入10０ｍlSＯB，37度,220ｒpm，3．5h后,ＯD550达０.３6（T43.7％),取出冰上放置5miｎ;将100ｍl菌液转入两个离心瓶中（平底）,ｓｐiｎ３K,5’，4℃，倒净上清，倒置于吸水纸上吸干剩余上清.之后步骤必须冰上进行,盐处理细胞后,操作轻柔；每管加入2０mｌＴｂfI重悬，轻柔操作，冰上放置5’，spin3K，5’,4℃。倒去上清，并倒置于吸水纸上;每管加入2mｌTｂfll重悬,轻柔操作，冰上放置1５'；每管50ul分装。液氮速冻,—８０度储存,标明制作日期，细菌种类;７、留出一管做鉴定，分别直接涂布阴性,含AMP,含Kaｎa的板子；再分别转化抗ＡMP和抗Kaｎa的质粒，分别涂布含ＡMP，含Ｋaｎａ的