基因工程的基本操作程序讲义专家讲座

1.2基因工程基本操作程序专题1基因工程基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第1页（1）目标基因获取（2）基因表示载体构建（3）将目标基因导入受体细胞（4）目标基因检测与判定基因工程基本操作程序主要包含四个步骤：基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第2页一、目标基因获取（一）目标基因：主要是___________基因编码蛋白质如：与生物抗逆性相关基因与优良品质相关基因与生物药品和保健品相关基因与毒物降解相关基因与工业所需酶相关基因也可是含有调控作用因子（如增强子等）基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第3页（二）目标基因获取方法：1、从基因文库中获取（1）基因文库：将含有某种生物不一样基因许多DNA片断，导入到受体菌群体中，各个受体菌分别含有这种生物不一样基因，称为基因文库。（2）基因文库种类：部分基因文库基因组文库基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第4页基因组文库：包含了一个生物全部基因，其目标是分离有用目标基因和保留某种生物全部基因。部分基因文库：包含了一个生物部分基因，如cDNA文库。基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第5页提取某种生物全部DNA用适当限制酶切一定大小DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库基因组文库构建方法：基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第6页cDNA文库构建方法-----反转录法某种生物单链mRNA合成互补DNA形成双链DNA（即cDNA）导入受体菌中储存与载体连接cDNA文库逆转录酶（反转录酶）DNA聚合酶基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第7页

原核细胞基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游开启子终止子编码区:能编码蛋白质序列非编码区:不能能编码蛋白质序列（含基因表示调控序列）知识补充：基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第8页真核细胞基因结构能够编码蛋白质序列叫做外显子不能编码蛋白质序列叫做内含子内含子：外显子：

基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第9页真核细胞基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质序列内含子：不能编码蛋白质序列：有调控作用核苷酸序列，包含位于编码区上游RNA聚合酶结合位点（开启子）。非编码序列：包含非编码区和内含子基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第10页基因组文库和cDNA文库比较：基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第11页（3）从基因文库中得到目标基因方法：依据：目标基因相关信息。如：依据基因核苷酸序列基因功效基因在染色体上位置基因转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特征基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第12页2、利用PCR技术扩增目标基因（1）PCR技术：是一项在生物体外复制特定DNA片段核酸合成技术，短时间内大量扩增目标基因。（2）原理：DNA双链复制（3）条件：DNA模板引物（一对）4种脱氧核苷酸Taq酶（耐高温DNA聚合酶）缓冲液基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第13页（4）过程：变性、退火、延伸三步曲①变性：

双链DNA→单链DNA55℃～60℃②退火：90℃～95℃引物与单链DNA模板结合(碱基互补配对)③延伸：70℃～75℃

Taq酶作用下，从引物起始进行互补链延伸基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第14页基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第15页（5）结果：每循环一次，目标基因可增加一倍，呈指数形式（2n）扩增。PCR扩增仪基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第16页PCR技术扩增与DNA复制比较PCR技术DNA复制相同点标准原料条件不一样点解旋方式场所酶结果碱基互补配对标准4种脱氧核苷酸模板、能量、DNA聚合酶DNA在高温变性解旋解旋酶催化体外复制细胞内热稳定DNA聚合酶细胞内DNA聚合酶大量DNA片段形成整个DNA分子基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第17页3、人工合成法假如基因比较小，核苷酸序列又已知，也能够经过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。二、基因表示载体构建—基因工程关键1、构建表示载体目标：①使目标基因在受体细胞中稳定存在，而且能够遗传给下一代；②使目标基因能够表示和发挥作用。基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第18页2、基因表示载体组成及作用：复制原点目标基因开启子终止子标识基因基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第19页开启子：

位于基因首端一段有特殊结构DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合部位；作用：驱动基因转录出mRNA终止子：位于基因尾端一段有特殊结构DNA片断。作用：使转录终止基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第20页标识基因：为了判别受体细胞中是否含有目标基因，从而将有目标基因细胞筛选出来（如抗生素抗性基因）。注意：开启子与终止子不一样于起始密码和终止密码开启子与终止子位于DNA上，是DNA片段，与基因转录相关。起始密码和终止密码位于mRNA上，是3个相邻碱基，与翻译（蛋白质合成）相关。基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第21页基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第22页

克隆载体与表示载体组成：二者都有标识基因和复制原点两部分DNA片段。表示载体在克隆载体基础上增加了开启子、终止子，开启子、终止子对于目标基因表示必不可少。基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第23页三、将目标基因导入受体细胞1、转化：目标基因进入受体细胞内，而且在受体细胞内维持稳定和表示过程。2、惯用转化方法：（1）导入植物细胞方法：①农杆菌转化法（最惯用）基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第24页a.农杆菌：土壤中一个微生物，自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。b.农杆菌转化法原理：植物受伤时，伤口处细胞会分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌，农杆菌Ti质粒上T-DNA能够转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体DNA上。基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第25页

目标基因插入Ti质粒T-DNA上c.过程：优点：经济、有效基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第26页②基因枪法单子叶植物惯用方法，成本较高。③花粉管通道法简便经济（我国转基因抗虫棉）基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第27页（2）导入动物细胞方法：①惯用方法：显微注射法②惯用受体细胞：受精卵目标基因表示载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵→新性状动物③流程：基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第28页（3）导入微生物细胞方法：①原核生物特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少②方法：用Ca2+（或CaCl2溶液）处理细胞

感受态细胞表示载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子，完成转化。基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第29页四、目标基因检测与判定1、转基因生物DNA上是否插入了目标基因（1）方法：DNA分子杂交技术（2）过程：①.提取转基因生物基因组DNA②.用放射性同位标识目标基因DNA片段做探针，与转基因生物基因组杂交，若显示出杂交带，表明目标基因已插入染色体DNA中。基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第30页2、目标基因是否转录出mRNA（1）方法：分子杂交技术（2）过程：①.提取转基因生物mRNA②.用放射性同位标识目标基因DNA片段做探针，与转基因生物mRNA杂交，若显示出杂交带，表明目标基因转录出mRNA。基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第31页3、检测目标基因是否翻译成蛋白质（1）方法：抗原—抗体杂交

（2）原理：抗原与抗体特异性结合（3）过程：①.提取转基因生物蛋白质②.用针对目标基因表示蛋白质（抗原）抗体（放射性标识），与转基因生物蛋白质（抗原）杂交，若显示出杂交带，表明目标基因已形成对应蛋白质。基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第32页除了上述分子水平判定，有时还需进行个体生物学水平判定：比如做抗虫、抗病接种试验，以确定是否有抗性以及抗性程度；或对基因工程产品与天然产品功效进行活性比较，以确定功效是否相同基因工程的基本操作程序讲义专家讲座第33页【尤其提醒】关注“操作程序”中四个易混点(1)目标基因插入位点不是随意。目标基因

应插入到开启子与终止子之间部位。(2)目标基因与载体相连接时，可能出现3种连接方式，如目标基因—目标基因、目标基因—载体、载体—载体。为了预防目标基因或载体自连，基因工程中惯用2种不一样限制酶对目标基因和载体进行切割，并确保目标基因

定向连接（开启子在其前，终止子在其后，确保目标基