基因工程工具酶专业知识讲座

基因工程工具酶专业知识讲座基因工程工具酶专业知识讲座第1页自然界许多微生物体内存在着一些含有特异功效酶类。这些酶类参加微生物核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中含有主要作用，有酶还作为微生物区分自己和非己DNA进而降解非己DNA防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类取得了最好基因工程工具。伴随越来越多酶分子被发觉，许多厂商已将其克隆并开发成产品，工具酶数量和用途不停增加，不但简化了分子克隆操作，而且拓宽了研究领域。本章主要介绍用于基因工程各种工具酶。基因工程工具酶专业知识讲座第2页基因工程工具酶

限制性内切酶连接酶

DNA聚合酶

DNA修饰酶

RNA聚合酶磷酸激酶和磷酸酶核酸酶基因工程工具酶专业知识讲座第3页一、细菌限制—修饰作用和限制性内切酶发觉第一节限制性核酸内切酶①50年代后Luria和Human(1952)Bertani和Weigle(1953)发觉细菌“限制”现象.1、细胞限制—修饰作用基因工程工具酶专业知识讲座第4页Phageλ（k）感染E.colik不感染E.coliB(E.coliB限制λ（k）)②仍有少许λ(K)可在E.coliB中生存，是因

E.coliB对λ(K)进行了修饰。E.coliB修饰λ(k)*λ(k)感染E.coli(B)细菌怎样对λ噬菌体进行限制和修饰？基因工程工具酶专业知识讲座第5页①1962年W.Arber(瑞士)发觉，寄主对噬菌体修饰是在Phage入DNA上。

②1965年，Arber发觉修饰与λ降解相关，提出：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制—修饰系统(R-MRestriction-modificationsystem)。R-M系统是细菌安内御外主动办法。细菌限制—修饰系统基因工程工具酶专业知识讲座第6页即限制性内切酶和与其对应甲基化酶系统，称R-Msystem限制性内切酶识别特异DNA序列并打断DNA，同时对应甲基化酶能把该段特异序列甲基化，使得限制性内切酶无法识别。这种系统在细菌中起到了免疫作用，即外来入侵DNA在限制性内切酶作用下被水解，而细菌本身DNA在甲基化酶作用下被保护起来。

细菌限制和修饰现象基因工程工具酶专业知识讲座第7页基因工程工具酶专业知识讲座第8页

①1968年Linn和Arber从E.coliB中发觉限制酶,M.Meselson和R.yuan从E.coliK中分离到另一限制性内切酶。1970年Smith(美)在流感嗜血杆菌又发觉另一限制酶即限制酶Ⅱ。②限制酶功效：降解不一样源DNA，而不降解同源DNA。③1978年W.Arber、H.O.Smith(美)，Nathans(美)因发觉限制性内切酶及对其功效研究突出贡献取得诺贝尔奖。限制性内切酶发觉基因工程工具酶专业知识讲座第9页二、限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链核酸内切酶。（Restrictionendonuclease）基因工程工具酶专业知识讲座第10页2.性质内切酶。原核生物。即在核酸分子链内部制造切口酶。自我保护作用。3.功效细菌限制和修饰系统（R/M体系）1.起源基因工程工具酶专业知识讲座第11页限制性内切酶将侵入细菌体内外源DNA切成小片断。（1）限制（Restriction）基因工程工具酶专业知识讲座第12页细菌本身DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被本身限制性内切酶识别切割。（2）修饰（Modification）①Dam甲基化酶(Mec甲基化酶)GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基基因工程工具酶专业知识讲座第13页基因工程工具酶专业知识讲座第14页1973年H.OSmith和D.Nathans提议命名系统，命名标准以下：三、限制性内切酶命名1.用属名第一个字母和种名头两个字母组成3个字母略语表示寄主菌物种名。大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。基因工程工具酶专业知识讲座第15页4.

限制酶前面要带上R（Restriction)，修饰酶前面要带上M（Modification）。（现已省略）。2.

用一个右下标大写字母表示菌株或型。如Ecok,EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。3.

假如一个特殊寄主菌内有几个不一样限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoRI，EcoRV。基因工程工具酶专业知识讲座第16页EcoRIEscherichia属名Coli种类Ry13株系编号

若种名头2个字母相同则其中一个可用种名第一和第三个字母。基因工程工具酶专业知识讲座第17页I型限制性内切酶当前判定出三种不一样类型限制性内切酶。四、限制性内切酶类型II类限制性内切酶III类限制性内切酶基因工程工具酶专业知识讲座第18页首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离。（1）识别位点序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC1.I类限制性内切酶如EcoB和EcoK。未甲基化修饰特异序列，非对称性。基因工程工具酶专业知识讲座第19页需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。（3）作用机理在距离特异性识别位点约1000—1500bp处随机切开一条单链。Recognizesitecut1-1.5kb（2）切割位点基因工程工具酶专业知识讲座第20页I类酶与DNA识别位点结合依赖于M亚基与辅助因子S-腺苷甲硫氨酸(SAM)相互作用，后者经过变构作用使酶处于活性状态。酶分子与识别位点结合之后，依据该位点甲基化状态发挥对应酶活性，或限制、或修饰、或既不限制也不修饰。I类酶切割位点与识别位点通常相距1,000-5,000bp，切割位点序列并不表现出严格特异性，两条DNA链上断裂位点相距70-75个核苷酸，所以切开DNA分子末端是单链形式。基因工程工具酶专业知识讲座第21页假如识别位点是全甲基化，则ATP使酶-SAM复合物脱离DNA双链；假如识别位点是半甲基化(即只有一条链甲基化)，则酶-SAM复合物在ATP帮助下使非甲基化DNA链甲基化，同时SAM转变为对应S-腺苷高半胱氨酸(SAH)；假如识别位点没有甲基化，ATP可使酶分子再次变构，暴露出限制性内切酶活性部位，先释放SAM，然后以一个未知机制在切割位点处将双链DNA切断，同时消耗ATP。基因工程工具酶专业知识讲座第22页首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。II类限制性内切酶分离第一个酶是HindⅡ该类酶是一个分子量较小单体蛋白，其双链DNA识别与切割活性仅需要Mg2+，且识别与切割位点序列大都含有严格特异性，因而在DNA重组及分子生物学试验中被广泛使用。基因工程工具酶专业知识讲座第23页（1）识别位点序列未甲基化修饰双链DNA；四、五或六个碱基对，而且含有180°旋转对称回文结构。与DNA起源无关。5‘

…GCT

GAATTC

GAG…3’3‘

…CGA

CTTAAG

CTC…5’EcoRI识别序列EcoRI切割位点基因工程工具酶专业知识讲座第24页绝大多数II类酶均在其识别位点内切割DNA，切割位点可发生在识别序列任何两个碱基之间。一个别酶识别相同序列，但切点不一样，这些酶称为同位酶（Isoschizomers），其中识别位点与切割位点均相同不一样起源酶称为同裂酶，如SstI与SacI、HindIII与HsuI等。有些酶识别位点不一样，但切出DNA片段含有相同末端序列，这些酶称为同尾酶（Isocandamers）。依据被切开DNA末端性质不一样，全部II类酶又可分为5’突出末端酶、3’突出末端酶以及平头末端酶三大类。II类酶分类基因工程工具酶专业知识讲座第25页（2）切割位点切开双链DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。如：识别位点处。EcoRV5’-GATÜATC-3’

3’-CTAÛTAG-5’Sam

I5’-GGGCGC-3’3’-CCCGGG-5

EcoRI5’-GÜAATTC-3’3’-CTTAAÛG-5’PstI5’-CTGCAÜG-3’3’-GÛACGTC-5’

产生粘性末端产生平齐末端基因工程工具酶专业知识讲座第26页（3）粘性末端（stickyends，cohensiveends）含有几个核苷酸单链突出末端。分两种类型：①5’端凸出（如EcoRI切点）GÜAATTC

CTTAA

GGAATTCCTTAAÛG5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’基因工程工具酶专业知识讲座第27页CTGCAÜG

②3’端凸出（如PstI切点）GÛACGTC5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAG

GACGTC基因工程工具酶专业知识讲座第28页①连接便利（4）粘性末端意义i）不一样DNA双链：只要粘性末端碱基互补就能够连接。ii）同一个DNA分子内连接：经过两个相同粘性末端能够连接成环形分子。这比连接两个平齐末端轻易多。基因工程工具酶专业知识讲座第29页基因工程工具酶专业知识讲座第30页③补平成平齐末端凸出3’端能够经过末端转移酶添加几个多聚核苷酸尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。②5’末端标识凸出5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标识。粘性末端能够用DNA聚合酶补平成平齐末端。基因工程工具酶专业知识讲座第31页识别位点序列相同限制性内切酶。（5）同裂酶（Isoschizomers)①完全同裂酶(同位酶)：识别位点和切点完全相同。如HindⅢ和HsuI。HindⅢ5’-AÜAGCTT-3’3’-TTCGAÛA-5’HsuI5’-AÜAGCTT-3’3’-TTCGAÛA-5’基因工程工具酶专业知识讲座第32页XmaI5’-CÜCCGGG-3’3’-GGGCCÛC-5’SmaI5’-CCCÜGGG-3’3’-GGGÛCCC-5’识别位点相同，但切点不一样。如XmaI和SmaI。②不完全同裂酶：基因工程工具酶专业知识讲座第33页识别序列不一样，但能切出相同粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等（6）同尾酶(Isocaudamers）5’-GÜGATCC-3’3’-CCTAGÛG-5’BamHIBclI5’-TÜGATCA-3’3’-ACTAGÛT-5’

5’-AÜGATCT-3’3’-TCTAGÛA-5’BglⅡ5’-UÜGATCY-3’3’-YCTAGÛU-5’XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。基因工程工具酶专业知识讲座第34页5’-ÜGATC----3’3’----CTAGÛ-5’

Sau3A同尾酶粘性末端相互结合后形成“杂种位点”普通不能再被原来酶识别。？5’-G3’-CCTAGGATCT-3’

A-5’BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡSau3A基因工程工具酶专业知识讲座第35页基因工程工具酶专业知识讲座第36页限制性内切酶识别和酶切活性普通在一定温度、离子强度、pH等条件下才表现最正确切割能力和位点专一性。（7）限制酶酶活性假如改变反应条件就会影响酶专一性和切割效率，内切酶出现切割与识别位点相同但不完全相同序列，这一现象称为星号（*）活性。所以普通使用专一反应缓冲液。①星号（*）活性

星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。基因工程工具酶专业知识讲座第37页基因工程工具酶专业知识讲座第38页EcoRI和BamHI等都有*活性,使用时要注意！！在低盐、高pH（>8）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：如：ECORI★识别特异性放宽，GAATTC→AATT基因工程工具酶专业知识讲座第39页较高甘油浓度（>5%v/v）；酶与底物DNA百分比过高（不一样酶情况不一样，通常为>100U/µg）；低盐浓度（<25mM）高pH值（>pH8.0）存在有机溶剂（如DMSO、乙醇(9)、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane(12)等）用其它二价离子替换镁离子（如Mn++，Cu++，Co++，Zn++等）造成星号活性原因基因工程工具酶专业知识讲座第40页以下酶类易出现“星号活性”，它们是

BamHI，Bcl

I，BseBI，BssAI，EcoRI，EcoRV，HindIII，HpaI，Kpn

I，NcoI，NruI，Pst

I，PvuII，SalI，ScaI，SnaBI，SphI，SspI，XbaI。以上原因影响程度因酶不一样而有所不一样。比如EcoRI比PstI对甘油浓度更敏感，而后者则对高pH值更敏感一些(2)。基因工程工具酶专业知识讲座第41页尽可能用较少酶进行完全消化反应。这么能够防止过分消化以及过高甘油浓度。尽可能防止有机溶剂（如制备DNA时引入乙醇）污染。将离子浓度提升到100-150mM（若酶活性不受离子强度影响）。将反应缓冲液pH值降到7.0。二价离子用Mg++。

抑制星号活性方法基因工程工具酶专业知识讲座第42页在离它不对称识别位点一侧特定距离处切割DNA双链。（8）Ⅱs型限制性内切酶移动切割（shiftedcleavage):GACGCNNNNNä

HgaICTGCGNNNNNNNNNNã5’3’基因工程工具酶专业知识讲座第43页3.III类限制性内切酶在完全必定位点切割DNA，但反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG基因工程工具酶专业知识讲座第44页III类限制-修饰酶由R亚基和MS亚基组成，其中MS亚基含有位点识别和甲基化修饰双重活性。该类酶与DNA识别位点结合严格依赖ATP，在与识别位点结合之后，修饰作用与限制作用取决于两个亚基之间竞争。修饰作用在识别位点内进行，甲基化受体是腺嘌呤碱基，供体仍为SAM。切割位点位于识别位点一侧若干碱基对处，但无序列特异性，只与识别位点距离相关，而且不一样III类酶含有各自不一样距离，从7至26bp不等。基因工程工具酶专业知识讲座第45页基因工程工具酶专业知识讲座第46页五、影响限制性内切酶活性原因

1、底物DNA1)DNA纯度DNA中杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶活性。

RNA与E结合影响有效酶浓度；RNA影响(干扰)电泳区带。

2)DNA浓度〔DNA〕过大，会抑制酶活(影响酶分子扩散)。基因工程工具酶专业知识讲座第47页

如：4μgDNA/1UHPaⅠ50μl在37℃下15h

而1μgDNA/1UHPaⅠ50μl在37℃下1h3）识别位点及邻近位点特异性序列

因为切点邻近序列不一样，水解速度不一样。如：①λDNA有5个ECORI切点，其中两个相差10倍。②pBR322DNA有4个NarⅠ切点(GGCGCC)其中2个切点用1U酶水解1h完全切开,2个切点用50U酶水解16h水解不完全。③XmaⅢ切点是CGGCCG，但在GGCGGCCGCC时不切割基因工程工具酶专业知识讲座第48页4)DNA二级/三级结构

超螺旋DNA(病毒或质粒)比线状DNA需更多酶。5)提取时混入杂质可改变识别特异性

如：高浓度Hg2+、酚，氯仿、乙醇、EDTASDS、NaCl等。基因工程工具酶专业知识讲座第49页大肠杆菌普通有两种甲基化酶修饰质粒：2.DNA甲基化程度dam甲基化酶（修饰GATC中A）；dcm甲基化酶（修饰CCA/TGGC）。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变菌株。基因工程工具酶专业知识讲座第50页不一样限制性内切酶最适反应温度不一样。大多数是37oC，少数要求40-65oC。504525BanIMaeISmaI306055ApyIBstEIIMaeIII30505065ApaIBclIMaeIITaqI最适温度oC酶最适温度oC酶最适温度oC酶3.温度基因工程工具酶专业知识讲座第51页是影响限制酶活性主要原因。4.缓冲液(Buffer)（1）缓冲液化学组成金属离子①如Ⅱ型酶需Mg2+，若以Mn2+代替Mg2+（如HindⅢ，ECORI）则特异性改变。②离子浓度，适当→激发酶活；不适当→抑制酶活。

牛血清蛋白(BSA)基因工程工具酶专业知识讲座第52页MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl：维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有利于酶稳定；BSA是酶稳定剂，机制：降低蛋白酶及非特异性吸附作用。防止热、表面张力、化学品造成酶变性。过量BSA会引发电泳拖尾。可经过加SDS/65℃/5min除去。

水无离子水，ddH2O，双蒸水。无菌、无污染、配成关键缓冲液，即几个酶相近buffer商品化限制酶普通都带有专用缓冲液。基因工程工具酶专业知识讲座第53页六、限制性内切酶对DNA消化1.内切酶与识别序列结合模式1986年J.A.McClarin等经过X射线晶体衍射发觉II类限制酶是以同型二聚体形式与靶序列结合。GAATTCCTTAAG基因工程工具酶专业知识讲座第54页内切酶在DNA上全部识别位点都被切开。2.完全消化12341234基因工程工具酶专业知识讲座第55页只有有限数量酶切位点被切开。经过缩短保温时间、降低反应温度或降低酶用量可到达局部消化目标。3.局部消化123414基因工程工具酶专业知识讲座第56页大多数酶可用65oC温育5分钟失活。或用乙醇沉淀DNA。4.限制酶酶切反应终止5.几个常见限制酶识别位点基因工程工具酶专业知识讲座第57页基因工程工具酶专业知识讲座第58页要做定向克隆，通常要作双酶切。同时双酶切是一个省时省力常见方法。选择能让两种酶同时作用最正确缓冲液是非常主要一步。酶切所用缓冲液能够从各企业酶活性图表中选择。6.双酶切基因工程工具酶专业知识讲座第59页基因工程工具酶专业知识讲座第60页双酶切注意事项

选活性最少都在80％以上buffer

注意反应温度

1）温度一致时可同时进行

2）温度不一致时，先切温度低，再切温度高假如找不到同时适合两种酶缓冲液，能够按两种酶条件按次序进行酶切反应。先用需要在低盐条件下反应限制性内切酶来切割，然后提升盐浓度以完成第二次切割。最好先切一个，回收后再切另一个.基因工程工具酶专业知识讲座第61页因为内切酶在非最正确缓冲液中进行双酶切反应时，反应速度会减缓，所以需要增加酶量或延长酶切时间来提升酶切速率。基因工程工具酶专业知识讲座第62页从细菌DNA环化现象推测，必定存在一个能把两条DNA双链连接到一起酶。第二节DNA连接酶一、DNA连接酶（ligase)发觉DNA复制一定有断口。基因工程工具酶专业知识讲座第63页DNA连接酶旧称“合成酶”。是1967年在三个试验室同时发觉，最初发觉于大肠杆菌。它是一个封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供能量催化DNA链5‘-PO4与另一DNA链3’-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。基因工程工具酶专业知识讲座第64页（1）大肠杆菌连接酶1.两种DNA连接酶只能连接粘性末端。分子量74000dal,辅因子NAD+,其作用是封闭双螺旋骨架上含有5‘-磷酰基和3’-羟基缺口，形成磷酸二酯键。二、DNAligase特点（2）T4噬菌体连接酶T4DNA连接酶来自于T4噬菌体感染E.coli，为T4噬菌体本身表示产物。分子量6.8万dal，辅因子位ATP，该酶既能连接粘性末端，亦能连接齐平末端。基因工程工具酶专业知识讲座第65页（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA3’端有游离-OH，

5’端有一个磷酸基团（P）。（3）需要能量动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中：NAD+2.连接条件基因工程工具酶专业知识讲座第66页1.ATP（NAD+)提供激活AMP。三、连接反应机理2.ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。3.AMP与连接酶赖氨酸e-氨基相连。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2++H3NAMPATPPPi基因工程工具酶专业知识讲座第67页4.AMP随即从连接酶赖氨酸e-氨基转移到DNA一条链5‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMP基因工程工具酶专业知识讲座第68页5.3‘-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。基因工程工具酶专业知识讲座第69页

用DNA连接酶，可催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组分子。详细做法是，在体外将含有粘性末端DNA限制片断，插入到适当载体分子上，再用DNA连接酶连接，从而能够按照大家意图构建出新DNA杂种分子。粘性末端DNA片段连接（连接酶作用）

基因工程工具酶专业知识讲座第70页同种内切酶生产粘性末端连接5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'

5'

GCTTAA

5'5'

AATTCG5'

退火GCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGGCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAG基因工程工具酶专业知识讲座第71页用粘性末端构建重组体DNA最主要缺点：1、无法控制外源基因插入方向；2、由限制酶产生含有粘性末端载体DNA分子，在连接反应混合物中会发生自我环化作用，经连接酶作用，形成共价闭环稳定环形结构。克服该缺点方法是，用碱性磷酸酶预先处理线性载体DNA分子，以移去末端5‘磷酸基团，于是在连接反应中，它本身两个末端之间就再也不能被连接酶共价连接起来了。基因工程工具酶专业知识讲座第72页基因工程工具酶专业知识讲座第73页1、同聚物加尾法

是由美国斯坦福大学P.Labban和D.Kaiser1972年发展起来，能够连接任何两段DNA分子普遍性方法。原理：利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)转移核苷酸特殊功效，将同种核苷酸（dNTP)加到DNA分子单链延伸末端3‘-OH上。假如在目标基因两侧加polydA，则在载体两侧加polydT。长度普通10~40个残基。

平末端DNA片段连接

基因工程工具酶专业知识讲座第74页同聚物加尾法优点:1)首先不易本身环化.2)因为载体和外源片段末端是互补黏性末端，所以连接效率较高.3)用任何一个方法制备DNA都能够用这种方法进行连接.缺点：1)插入片段难以回收。2)无法控制外源基因插入方向。3)用任何一个方法制备DNA都能够用这种方法进行连接.基因工程工具酶专业知识讲座第75页人工粘性末端连接

平头末端C3'

GG5'

G3'C5'C3'GT4-DNAligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT3'C退火C3'

TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA

3'

GG3'

AAAAAAAAAAC5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGC3'

5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG基因工程工具酶专业知识讲座第76页人工粘性末端连接

3‘突出末端CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火PstIPstIC3'

CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowPstISphI基因工程工具酶专业知识讲座第77页人工粘性末端连接

5‘突出末端5'GCCTAGGATCCG5'

5'

GCTTAA5'5'5'

AATTCGT4-DNAligase5'

5'Klenow补平Klenow补平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGG5'

GAATTCTTAA5'5'5'

AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAAAATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5'

5'GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火BamHIBamHIEcoRIBamHI基因工程工具酶专业知识讲座第78页衔接物（linker)连接法所谓衔接物是指用化学方法合成一段由10~12个核苷酸组成，含有一个或数个限制酶识别位点平末端双链寡核苷酸段片断。将衔接物5‘末端和待克隆DNA片段5’末端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后经过T4DNA连接酶作用使二者连接起来，接着用适当限制酶消化具衔接物DNA分子和载体分子，由此使二者都产生出彼此互补粘性末端。优点：克隆后还可回收原插入片断。基因工程工具酶专业知识讲座第79页基因工程工具酶专业知识讲座第80页基因工程工具酶专业知识讲座第81页DNA衔接物连接法尽管有很多优点，但显著缺点是，假如待克隆DNA片段或基因内部也含有与所加衔接物相同限制位点，这么在酶切消化衔接物产生粘性末端同时，也会把所克隆基因切成不一样片段，从而对后继亚克隆及其它操作造成麻烦。基因工程工具酶专业知识讲座第82页DNA接头(adaptor)连接法DNA接头是由美国康奈尔大学吴瑞博士于1977年创造，它是一类人工合成一头含有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端特殊双链寡核苷酸短片段。当它平末端与平末端外源DNA片段连接后，便会使后者成为含有粘性末端新DNA分子，而易于连接重组。问题：各个DNA接头分子粘性末端之间，会经过互补碱基间配对作用，形成如同DNA衔接物一样二聚体分子，失去接头原来意义。克服方法是将5‘末端磷酸修饰移去，其结果为暴露出5’-OH所取代。如此一来，即使两个接头分子粘性末端之间仍含有互补碱基配正确能力，但终因DNA连接酶无法在5‘-OH和3’–OH之间形成磷酸二酯键而不会产生出稳定二聚体分子。基因工程工具酶专业知识讲座第83页基因工程工具酶专业知识讲座第84页基因工程工具酶专业知识讲座第85页连接酶反应最正确温度是37°C。四、连接反应温度1.最正确温度但在37℃下粘性末端结合很不稳定。2.实用温度所以普通采取4~16°C。基因工程工具酶专业知识讲座第86页增加插入片段与载体接触机会，降低载体自我连接现象。1.插入片段与载体浓度百分比2.反应温度五、影响连接反应原因10~20倍。普通14~16℃基因工程工具酶专业知识讲座第87页第三节DNA聚合酶一、基因工程中常见DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ(全酶)(E.coli)Klenowfragment(E.coli)T４DNA聚合酶(T４Phage感染E.coli)T７DNA聚合酶(T７Phage感染E.coli)修饰T７DNA聚合酶(测序酶)DNA末端转移酶(小牛胸腺)反转录酶(依赖RNA)聚合酶基因工程工具酶专业知识讲座第88页1.共同特点把dNTPs连续地加到引物3’—OH端。2.主要区分T7DNA聚合酶能够连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几个DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。二、常见DNA聚合酶特点连续合成能力和外切酶活性不一样。基因工程工具酶专业知识讲座第89页高快有无TaqDNA聚合酶中低无无逆转录酶高快无无遗传修饰T7DNA聚合酶高快无高T7DNA聚合酶低中无高T4DNA聚合酶低中无低Klenowfragment低中有低大肠杆菌DNA聚合酶连续能力聚合速率5’®3’外切酶活性3’®5’外切酶活性DNA聚合酶3.常见DNA聚合酶特征比较基因工程工具酶专业知识讲座第90页三、DNA聚合酶在基因工程中用途1.大肠杆菌DNA聚合酶I主要用来制备带放射性标识DNA探针。（1）大肠杆菌DNA聚合酶I性质①一条单链多肽。②5’®3’外切酶活性位于N端。③用枯草杆菌蛋白酶处理能够切掉N端5’®3’外切酶活性个别。就成为Klenowfragment。基因工程工具酶专业知识讲座第91页①底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）②Mg2+③带有3’—OH游离端引物④DNA模板（2）DNA聚合酶I（PolI）反应条件-OH5’3’dNTPs基因工程工具酶专业知识讲座第92页标识①核酸探针（probe）能够同某种被研究核酸序列特异性结合，带有标识寡聚核酸分子。（3）用DNA聚合酶I制备探针已知序列核酸片断显示位置与互补待测序列杂交基因工程工具酶专业知识讲座第93页标识已知序列核酸片断②探针标识方式标识已知序列核酸片断带有放射性已知序列核酸片断5’3’基因工程工具酶专业知识讲座第94页③DNA聚合酶I对探针序列标识切口转移法(nicktranslation)：放射性同位素标识：DNA聚合酶I同时具备5’®3’外切酶活性和5’®3’聚合酶活性（以及3’®5’外切酶活性）。基因工程工具酶专业知识讲座第95页5’®3’外切酶活性从DNA切口下一段DNA5’端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口上一段DNA3’一侧补上一个新核苷酸。切口切口5’5’3’3’5’3’5’3’基因工程工具酶专业知识讲座第96页纯化DNA片断DNaseI制造单链切口DNAPolI进行切口转移一个a-32P-dNTP和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’3’32P-dNTP32P-dNTP从头至尾都被标识8基因工程工具酶专业知识讲座第97页缺口平移法快速、简便、成本相对较低、比活性较高、标识均一。主要利用了DNA聚合酶Ⅰ修复DNA功效，用于大分子DNA标识（＞1000bp最好）；缺点：单链DNA、RNA不能用该法标识。基因工程工具酶专业知识讲座第98页2.Klenowfragment(DNA聚合酶I大片段)

含有5’®3’聚合酶活性和3’®5’外切酶活性。（失去了5’®3’外切酶活性）。（1）Klenowfragment性质基因工程工具酶专业知识讲座第99页C端76，000dKlenow活性５′→３′聚合３′→5′外切＋N端36，0005′→３′外切Jacobsen(1974),Joyce和Grindley,(1983)克隆此大片段。DNAPolI枯草杆菌蛋白酶基因工程工具酶专业知识讲座第100页①3’端补平5’5’klenow②DNA3’末端标识补平限制性内切酶切后形成3’隐蔽端。在3’隐蔽端加上放射性标识dNTP。klenow（2）主要用途基因工程工具酶专业知识讲座第101页3’隐蔽末端DNA片断Klenowfragment补平依据末端次序选择一个a-32P-dNTPs末端标识DNA限制性内切酶切5’----G3’3’----CTTAA5’5’----GAA3’3’----CTTAA5’5’----GAATT3’3’----CTTAA5’5’----G3’3’----CCTAG5’5’----GG3’3’----CCTAG5’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’EcoRIBamHIa-32P-dATPa-32P-dGTP25oC1h基因工程工具酶专业知识讲座第102页③cDNA第二链合成mRNAcDNA第一链逆转录cDNA第二链klenow5’3’3’5’5’3’引物基因工程工具酶专业知识讲座第103页随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶作用下,合成DNA探针。合成产物大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶量。通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。④随机引物法标探针基因工程工具酶专业知识讲座第104页优点：(1)Klenow片段没有5‘→3’外切酶活性,反应稳定,能够取得大量有效探针。(2)反应时对模板要求不严格,用微量制备质粒DNA模板也可进行反应。(3)反应产物比活性较高,可达4×109cpm/μg探针缺点：不能标识环状DNA基因工程工具酶专业知识讲座第105页纯化DNA片断加热变性klenow进行5’-3’聚合反应随机引物，一个a-32P-dNTP和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’32P-dNTP32P-dNTP基因工程工具酶专业知识讲座第106页（1）T4DNA聚合酶性质3.T4DNA聚合酶从T4噬菌体感染后大肠杆菌培养物中分离纯化。由噬菌体基因43编码。有5’®3’聚合酶活性和3’®5’外切酶活性（降解单链更加快）。①起源②酶活性基因工程工具酶专业知识讲座第107页③特点当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使3’®5’外切酶功效，制造出3’隐蔽端。假如只有一个dNTP，则降解到该dNTP位置。基因工程工具酶专业知识讲座第108页5’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶无dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’5’基因工程工具酶专业知识讲座第109页（2）T4DNA聚合酶用途标识末端（取代合成法）用3’®5’外切酶活性作用于全部末端形式3’端（平端、3’隐蔽端、5’隐蔽端）制造出3’隐蔽端。再利用它5’®3’聚合酶活性补平，并加入放射性标识dNTP。①补平隐蔽末端②DNA3’末端标识基因工程工具酶专业知识讲座第110页酶切中间产生两个末端标识加入某种32P-dNTP和dNTPsT4DNA聚合酶（3’®5’外切）DNA酶切片断T4DNA聚合酶（5’®3’聚合）5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’内切酶切无dNTPs基因工程工具酶专业知识讲座第111页4.T7DNA聚合酶（1）起源从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来，由两个亚基组成：①T7基因5编码大亚基：有5’®3’聚合酶和3’®5’外切酶活性。②大肠杆菌编码小亚基：

硫氧还蛋白。增加大亚基对模板亲和性。基因工程工具酶专业知识讲座第112页（2）T7DNA聚合酶特点①连续合成能力强一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。②3’®5’外切酶活性高单链和双链都能降解。③不受DNA二级结构影响其它DNA聚合酶受DNA二级结构妨碍基因工程工具酶专业知识讲座第113页②进行末端标识①以大分子量DNA为模板合成如M13③补平隐蔽末端（3）T7DNA聚合酶用途取代合成法标识3’末端。与T4DNA聚合酶相同。合成补平3’隐蔽末端；水解修平3’突出末端。基因工程工具酶专业知识讲座第114页5.修饰T7DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶化学修饰去除3’®5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提升了3倍。（2）修饰后T7DNA聚合酶用途①DNA测序双脱氧法。②标识DNA3’隐蔽末端③更有效地补平末端基因工程工具酶专业知识讲座第115页起源：是一个只在前淋巴细胞和淋巴细胞分化早期阶段中存在罕见DNA聚合酶(Chang和Bollum,1986)。结构：MW=60，000d.活性：①催化dNTP掺入DNA3′-OH末端，形成同聚物末端②反应不需模板DNA，需Co2+。用途：①克隆DNA片段时加上互补同聚物末端，便于与载体连接。②末端标识6.末端转移酶(不依赖模板DNA聚合酶)基因工程工具酶专业知识讲座第116页商品反转录酶有两种①来自禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)。②来自鼠类白血病病毒（MMLV）反转录酶。7.逆转录酶依赖RNADNA聚合酶（RNA指导DNA聚合酶）。（1）起源基因工程工具酶专业知识讲座第117页酶类别肽链5’-3’聚合活性RNaseHAMV2条：α：6β：94000有强MMLV1条84000有弱RNaseH：以5’®3’或3’®5’方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中RNA链。基因工程工具酶专业知识讲座第118页合成长cDNAM-MLV优于AMV.RNaseHRNADNARNADNA基因工程工具酶专业知识讲座第119页（3）逆转录酶用途①合成cDNA以oligodT为引物（与mRNApolyA尾巴互补结合）。AAAAATTTTT5’3’mRNA5’cDNA基因工程工具酶专业知识讲座第120页

核酸探针是指带有标识物已知序列核酸片段，它能和与其互补核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列检测。核酸探针(Nucleicacidprobe)基因工程工具酶专业知识讲座第121页1).按起源及性质划分

可将核酸探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和人工合成寡核苷酸探针等几类。

较常使用是基因组DNA探针和cDNA探针。

2).按标识物划分

有放射性标识探针和非放射性标识探针两大类。1.核酸探针种类基因工程工具酶专业知识讲座第122页放射性标识探针用放射性同位素做为标识物。常见同位素32P、3H、35S。其中，以32P应用最普遍。1.放射性标识探针优点：灵敏度高，能够检测到pg级。

放射自显影效果好。缺点：半衰期短（32P只有14.3天）不易保留、对人体有害。要求在专门试验室操作。基因工程工具酶专业知识讲座第123页2.非放射性标识探针i）生物素标识：生物素（biotin），又称维生素H、辅酶R能够与dNTP酰化结合成为生物素-1,6-dUTP、生物素-1,4-dATP、生物素-1,1-dUTP等。CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH也能够被生物素连接酶（biotinligase）催化与蛋白质共价结合。基因工程工具酶专业知识讲座第124页纯化DNA片断DNaseI制造单链缺口DNAPolI进行缺口转移生物素-dTTP和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’3’生物素-dTTP生物素-dTTP利用缺口转移法将生物素掺入DNA探针中基因工程工具酶专业知识讲座第125页光敏生物素标识生物素连接臂光敏基团探针序列探针序列生物素连接臂光敏基团+光照基因工程工具酶专业知识讲座第126页在强光下，不需酶反应，光敏生物素光敏基团即可与核酸中碱基相结合。光敏生物素标识核酸，方法简单，灵敏度也不低，但标识效率不高，每100～150个碱基才能标识一个生物素，对于短基因探针尤其是寡核苷酸探针不宜使用，以免因标识数过少而影响灵敏度（Forsteretal1985）。基因工程工具酶专业知识讲座第127页抗生物素蛋白（avidin）：链霉抗生物素蛋白（streptavidin）：生物素识别——亲和素：是一个鸡卵清蛋白。细菌中avidin类似物。能与生物素特异结合蛋白或抗体，常见：基因工程工具酶专业知识讲座第128页ii）地高辛标识：能够与dNTP连接成地高辛-dUTP等，参入DNA合成过程。形成地高辛标识DNA探针。生物素和地高辛标识探针都有商品化试剂盒(kit)。地高辛结合物是抗地高辛抗体。基因工程工具酶专业知识讲座第129页iii）偶联酶及其底物常见两种酶：辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRPO）碱性磷酸酶（AlkalinePhosphatase,AP）催化一些特殊反应，反应过程中发出荧光（或生成有色产物）。酶作用：基因工程工具酶专业知识讲座第130页HRPO和AP显色反应底物基因工程工具酶专业知识讲座第131页碱性磷酸酶催化发光反应机理金刚烷基因工程工具酶专业知识讲座第132页iv）用非放射性标识探针检测原理生物素探针序列待测基因亲和素酶底物中间产物产物发光探针DNA用生物素或地高辛标识。亲和素或地高辛抗体与酶偶联。酶催化一个发光或显色反应。亲和素或地高辛抗体与生物素或地高辛结合。基因工程工具酶专业知识讲座第133页基因工程工具酶专业知识讲座第134页一、T4多核苷酸激酶1.起源T4噬菌体pseT基因编码。从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。各种哺乳动物细胞中也发觉这种酶。2.功效催化g磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA5’-OH端。不论5’-OH端突出是否。第四节DNA修饰酶基因工程工具酶专业知识讲座第135页5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’P--OH5’3’HO--P5’ATPT4多核苷酸激酶假如ATPg磷酸带有32P标识，就会被转移到DNA5’端。但天然DNA5’端都是磷酸化。基因工程工具酶专业知识讲座第136页3.多核苷酸激酶用途DNA5’-OH端磷酸化、标识DNA5’端。5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’32P--OH5’3’HO--32P5’(g-32P)ATP多核苷酸激酶3’P--OH5’3’HO--P5’碱性磷酸酶（1）正向反应（forwardreaction）基因工程工具酶专业知识讲座第137页（2）交换反应标识法反应混合物中含有超量(g-32P)ATP和ADP时，多核苷酸激酶能催化(g-32P)ATPg-32P与DNA5’端磷酸交换。3’P--OH5’3’HO--P5’3’32P--OH5’3’HO--32P5’(g-32P)ATP、ADP多核苷酸激酶反应效果不理想。基因工程工具酶专业知识讲座第138页

二、碱性磷酸酶1.碱性磷酸酶种类从大肠杆菌中分离出来。Bacterialalkalinephosphatase，BAP（1）细菌性碱性磷酸酶（2）小牛肠碱性磷酸酶Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP从小牛肠中纯化出来。含有抗热性。SDS中加热68oC可完全失活。基因工程工具酶专业知识讲座第139页2.碱性磷酸酶特征催化脱掉DNA（或RNA）5’端磷酸根。3’P--OH5’3’HO--P5’5’3’HO--OH5’3’HO--OH碱性磷酸酶3.碱性磷酸酶功效（1）预防线性化载体份子自我连接基因工程工具酶专业知识讲座第140页单一酶切口载体粘性末端轻易自我连接。AAGCTTTTCGAAHindⅢ酶切A-OHTTCGA-PP-AGCTTHO-A碱性磷酸酶5’5’5’基因工程工具酶专业知识讲座第141页A-OHTTCGA-OHHO-AGCTTHO-AOH与OH不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。但同一酶切后外源DNA5’端有P，能与脱磷酸载体3’OH连接。基因工程工具酶专业知识讲座第142页aATTCGAAGCTTAAGCTTAATTCGA连接酶-OH与-OH连不住其中每条链上都有一个nick，但转入细菌后会被修复。3’P-AGCTTA-OH5’3’HO-ATTCGA-P5’外源DNA基因工程工具酶专业知识讲座第143页第五节RNA聚合酶1.RNA聚合酶①T7、T3RNA聚合酶在E.coli中克隆表示。②T7、T3、