外源基因的原核表达专家讲座

外源基因表示作用：外源基因表示泛指目标基因与表示载体重组后，导入适当受体细胞，并能在其中有效表示，产生目标基因产物。外源基因表示是研究和探索基因功效、基因表示调控机制、编码蛋白质结构与功效主要方法，也是制备和生产新型蛋白质药品、诊疗试剂必不可少伎俩。经过外源基因表示可由宿主细胞产生大量目标蛋白。4/25/20231外源基因的原核表达专家讲座第1页惯用原核外源表示系统大肠杆菌表示系统芽孢杆菌表示系统链霉菌表示系统蓝藻表示系统4/25/20232外源基因的原核表达专家讲座第2页原核生物基因表示系统特点：1、原核生物大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可经过发酵快速取得大量基因表示产物。2、基因组结构简单，便于基因操作和分析。3、多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建对应表示载体。4/25/20233外源基因的原核表达专家讲座第3页原核生物基因表示系统特点：4、不具备真核生物蛋白质加工系统，表示产物无特定空间构象。5、内源蛋白酶会降解表示外源蛋白，造成表示产物不稳定。因为以上特点，近年来真核生物表示系统发展很快，并构建了对应基因表示载体。4/25/20234外源基因的原核表达专家讲座第4页大肠杆菌表示系统大肠杆菌表示系统是基因表示技术中发展最早，当前应用最为广泛经典表示系统。属革兰氏阴性细菌。其特点是：遗传背景清楚目标基因表示水平高培养时间短4/25/20235外源基因的原核表达专家讲座第5页大肠杆菌表示系统主要不足1、缺乏真核生物蛋白质翻译后修饰和加工过程。2、表示蛋白质多以包含体形式存在，需经复性才能恢复构象与活性3、宿主本身杂蛋白质多，纯化步骤复杂。4/25/20236外源基因的原核表达专家讲座第6页大肠杆菌基因表示载体理想大肠杆菌表示载体特征1、稳定遗传和复制能力，在无选择压力下保留于大肠杆菌细胞内2、含有显性转化筛选标识3、转录能够调控，抑制时本底转录水平较低4、转录mRNA能够在适当位置终止且转录不影响载体复制5、具备适合用于外源基因插入酶切位点4/25/20237外源基因的原核表达专家讲座第7页大肠杆菌基因表示载体组成1、复制子：是一段包含起始位点和反式因子作用区在内DNA片段。其功效是经过复制使载体稳定存在于大肠杆菌细胞。4/25/20238外源基因的原核表达专家讲座第8页大肠杆菌基因表示载体2、筛选标识：大肠杆菌经过转化后，仅有少数细菌能取得携带外源基因质粒并稳定地传代，筛选标识可有效地筛选出转化有外源基因阳性重组。4/25/20239外源基因的原核表达专家讲座第9页大肠杆菌基因表示载体3、开启子：是与DNA依赖RNA聚合酶相结合一段DNA序列。开启子是调控外源基因转录主要顺式作用元件，与mRNA合成有很大关系，是表示载体不可缺乏元件。4/25/202310外源基因的原核表达专家讲座第10页大肠杆菌基因表示载体4、终止子：在转录过程中能在特异位点将转录终止DNA序列。有两种类型1、ρ－因子型终止子2、转录产物二级结构4/25/202311外源基因的原核表达专家讲座第11页4/25/202312外源基因的原核表达专家讲座第12页大肠杆菌基因表示载体4、终止子：能在特异位点终止转录DNA序列。终止子有两种类型1、ρ－因子2、转录产物二级结构4/25/202313外源基因的原核表达专家讲座第13页4/25/202314外源基因的原核表达专家讲座第14页4/25/202315外源基因的原核表达专家讲座第15页终止子功效（1）、能能有效控制目标基因mRNA长度（2）、提升mRNA稳定性（3）、防止载体上其它基因异常表示4/25/202316外源基因的原核表达专家讲座第16页大肠杆菌基因表示载体5、核糖体结合位点：原核细胞mRNA蛋白合成起始点上游一段非编码序列。能与30S小亚基中16SrRNA3’末端一段序列特异结合。此序列富含嘌呤，关键序列为SD序列。4/25/202317外源基因的原核表达专家讲座第17页大肠杆菌基因表示载体6、密码子：密码子有简并性，多个密码子为一个氨基酸进行编码，不一样生物在利用这些密码子时其利用频率不一样，不一样密码子会影响到大肠杆菌翻译速度。4/25/202318外源基因的原核表达专家讲座第18页基因表示机制基因工程技术关键是基因表示技术。迄今为止，已构件建了不一样类型表示系统，可依据需要合理地选择适当表示系统。外源基因在受体细胞中表示包含：1、转录2、翻译两个步骤4/25/202319外源基因的原核表达专家讲座第19页基因表示机制基因工程关键问题：有效表示外源基因表示关键步骤：起始转录基因表示限速步骤：转录起始速率构建表示系统时首先要考虑问题是：1、选择可调控开启子2、相关调控序列4/25/202320外源基因的原核表达专家讲座第20页目标：在细胞生长早期不表示或低水平表示，当细胞增殖到一定密度时，在某种特定诱导因子诱导下开启转录合成mRNA。开启子原核生物开启子真核生物开启子诱导型诱导型组成型组成型4/25/202321外源基因的原核表达专家讲座第21页mRNA延伸与稳定性：有效表示关键是：保持mRNA1、有效延伸2、正确终止3、mRNA在细胞中稳定存在4/25/202322外源基因的原核表达专家讲座第22页mRNA有效延伸：造成mRNA转录提前终止可能原因有和处理方法1、衰减子：类似于简单终止子，在原核生物中普通位于操纵子开启子与第一个结构基因之间。在构建表示载体时应防止该序列存在。4/25/202323外源基因的原核表达专家讲座第23页2、非特异终止：预防非特异性终止方法是在构建表示载体时加入抗终止序列元件。4/25/202324外源基因的原核表达专家讲座第24页转录正确终止也是外源基因有效表示主要原因，能够预防产生无须要转录产物，使mRNA长度限制在一定范围内，从而增加外源基因表示稳定性。原核生物处理方法真核生物处理方法4/25/202325外源基因的原核表达专家讲座第25页mRNA在细胞中稳定存在：mRNA在受体细胞中稳定存在直接决定翻译产物多少。处理方法1、原核生物：选择一个RNase缺失工程菌株。2、真核生物：提升mRNA正确加工4/25/202326外源基因的原核表达专家讲座第26页外源基因mRNA有效翻译为使外源基因有效翻译，在构建表示体系时应考虑以下问题：1、AUG为首选起始密码子2、SD序列为与核糖体结合位点3、SD序列与起始密码子之间距离为3～9个碱基4、在翻译起始区周围序列不易形成显著二级结构5、选择适当终止密码子4/25/202327外源基因的原核表达专家讲座第27页表示蛋白在细胞中稳定性惯用办法有：1、构建融合蛋白表示系统2、构建分泌蛋白表示系统3、构建包涵体表示系统4、选择蛋白水解酶基因缺点受体系统4/25/202328外源基因的原核表达专家讲座第28页外源基因在大肠杆菌中表示产物在细胞位置：外源基因在大肠杆菌中表示产物可能存在于细胞质、细胞周质和细胞外培养基中。其表示形式包含形成：1、不溶性蛋白2、可溶性蛋白4/25/202329外源基因的原核表达专家讲座第29页大肠杆菌载体表示方式非融合表示载体融合表示载体带纯化标签表示载体分泌型表示载体表面展示表示载体带分子伴侣表示载体4/25/202330外源基因的原核表达专家讲座第30页1、非融合表示载体：应用此种载体表示蛋白质与天然状态下存在蛋白质在结构、功效和免疫原性等方面基本或完全一致。当前上市细胞因子类产品多采取这类表示载体。2、融合表示载体：分子量较小蛋白质惯用这类载体进行表示。将外源蛋白基因与受体菌本身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因阅读框。4/25/202331外源基因的原核表达专家讲座第31页在进行融合表示时，普通将受体菌蛋白位于N端，而外源蛋白位于C端。外源蛋白与菌体本身蛋白以融合蛋白方式表示后其稳定性大大增加。其原因为：外源小分子蛋白上酶切位点暴露于分子表面。当以融合蛋白形式表示后，外源蛋白部分在菌体本身蛋白引导下正确折叠，可最大程度上封闭酶切位点。4/25/202332外源基因的原核表达专家讲座第32页带纯化标签表示载体：载体上含有一段特殊序列，该序列表示后可作为纯化标签。目标基因与该序列融合表示后，用亲和层析方法很方便将目标蛋白分离，切除标签序列后可得到纯化目标蛋白。4/25/202333外源基因的原核表达专家讲座第33页分泌型表示载体：将目标基因与信号肽融合表示，表示蛋白在信号肽引导下成为分泌蛋白。表面展示载体：将目标基因克隆到细菌表面蛋白结构基因中，从而到达细菌表面表示。带分子伴侣表示载体：4/25/202334外源基因的原核表达专家讲座第34页4/25/202335外源基因的原核表达专家讲座第35页4/25/202336外源基因的原核表达专家讲座第36页4/25/202337外源基因的原核表达专家讲座第37页宿主菌大肠杆菌表示系统表示基因普通都是异源基因，甚至是真核生物基因，而在细胞内积累大量异源蛋白极易被降解。造成重组异源蛋白在大肠杆菌中不稳定原因有：1、大肠杆菌缺乏复杂翻译后加工和蛋白质折叠系统；4/25/202338外源基因的原核表达专家讲座第38页2、大肠杆菌不具备类似真核细胞亚细胞结构和表示产物稳定因子；3、大量异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度微环境，造成蛋白质分子之间作用增强。因为以上原因，为使外源基因高效表示，必须构建作为基因表示受体菌工程菌株。4/25/202339外源基因的原核表达专家讲座第39页常见大肠杆菌表示系统Lac和Tac表示系统：以lac操纵子调控机制为基础设计和构建表示系统。经过对大肠杆菌tacI基因诱变，取得能过量表示lacI

阻遏蛋白基因突变体lacIq，使外源基因表示调控在一定水平。另外，当前还构建了阻遏蛋白温度敏感型突变体lacIq(ts)宿主菌和载体，使lac和tac开启子转录受温度控制，在低温(30oC)下基因转录受到抑制，在(42oC)下基因转录保持开放。4/25/202340外源基因的原核表达专家讲座第40页常见大肠杆菌表示系统PL和PR开启子表示系统：以λ噬菌体早期转录开启子PL和PR构建。在野生型λ噬菌体中，PL和PR开启子转录是否决定λ噬菌体进入裂解循环或溶原循环。λ噬菌体PE开启子控制cl基因表示产物是PL和PR开启子转录阻遏物，而其表示和在细胞中浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子这间复杂平衡关系。经过细胞因子调整cl在细胞中含量路径极难操作，所以在构建表示体系时，选取温度敏感突变体cl1857(ts)基因产物调控PL和PR开启子转录。4/25/202341外源基因的原核表达专家讲座第41页常见大肠杆菌表示系统T7表示体系：利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统元件构建，含有很高表示能力表示系统。T7噬菌体RNA聚合酶能选择性地激活T7噬菌体开启子转录，这是一个活性很高RNA聚合酶，其合成mRNA速率相当于大肠杆菌RNA聚合酶5倍。在大肠杆菌宿主细胞中，受T7噬菌体开启子控制基因在T7噬菌体RNA聚合酶存在下进行高表示。4/25/202342外源基因的原核表达专家讲座第42页常见大肠杆菌基因表示受体菌株菌株基因型开启子BL21hsdSgalT7噬菌体HMS174recA1hsdRrifT7噬菌体M5279lacZtrpArpsLλ噬菌体PL

RB791W3110lacIqL8lac,tac4/25/202343外源基因的原核表达专家讲座第43页大肠杆菌高效表示目标基因策略对表示相关元件进行优化提升稀有密码子tRNA表示作用提升外源基因表示产物稳定性优化发酵过程提升外源基因mRNA稳定性4/25/202344外源基因的原核表达专家讲座第44页表示相关元件优化主要包含与表示相关开启子序列和决定mRNA翻译SD序列。详细方法为组合强开启子和强终止子；增加SD序列中与核糖体16SrRNA互补配正确碱基序列；调整SD序列与起始密码ATG之间距离及碱基种类；预防核糖体结合位点附近序列转录后形成发卡结构。4/25/202345外源基因的原核表达专家讲座第45页表示质粒优化和设计构建表示质粒时首先要考虑使目标基因翻译起始密码ATG与SD序列之间距离和碱基组成处于一个适当范围内。核糖体结合位点序列改变对mRNA翻译效率有显著影响，详细表现为：

SD序列UAAGGAGG翻译效率要比AAGGA高3～6倍翻译起始密码ATG与UAAGGAGG最适距离是6～8个碱基长度，与AAGAA最适距离是5～7个碱基长度ATG与UAAGGAGG最少相隔3～4个碱基，与AAGAA最少相隔5个碱基；mRNA翻译才能进行ATG与SD序列之间碱基组成为A，T碱基丰富时，mRNA翻译效率较高。4/25/202346外源基因的原核表达专家讲座第46页

核糖体结合位点本身和附近序列决定了目标基因mRNA5’端二级结构，研究表明讨mRNA5’端形成“茎环”结构妨碍了mRNA与核糖体30S亚基结合，从而抑制了翻译起始。尽可能提升核糖体结合位点本身和附近序列中A/T碱基含量，降低mRNA5’端形成“茎环”结构可能性，也是构建表示质粒时需要注意事项。在必要情况下，还可经过定点突变，PCR等技术改变个别关键碱基来破坏mRNA5’端“茎环”结构。把目标基因设计成多顺反子结构，在大肠杆菌本身高效翻译起始元件后加上第二个SD序列和目标基因，一起插入表示载体。这一方法通常适合用于目标基因5’端序列轻易形成二级结构，而又不宜改变其序列情形下4/25/202347外源基因的原核表达专家讲座第47页表示质粒优化和设计

在构建表示质粒时，充分利用各个基因结构特征和特点，注意引入翻译增强子序列

能提升mRNA翻译效率特殊核苷酸序列，称为翻译增强子。

4/25/202348外源基因的原核表达专家讲座第48页提升稀有密码子tRNA表示作用简并密码子使用频率不一样与对应tRNA在细胞中丰度相关。过多使用低丰度tRNA时，会因tRNA耗尽而影响翻译。可将外源基因中同义密码子进行点突变，成为受体菌中惯用密码子而提升表示能力。4/25/202349外源基因的原核表达专家讲座第49页共表示大肠杆菌稀有密码子tRNA基因表示水平高基因展现密码子偏爱性高于表示水平低基因。

现已说明在大肠杆菌中稀有密码子有：编码Arg密码子AGA、AGG、CGA、CGG编码Pro密码子CCC、CCU、CCA编码Cys密码子UGU、UGC;编码Gly密码子GGA、GGG编码Leu密码子CUA、CUC编码Ile密码子AUA编码Ser密码子UCA、AUG、UCG、UCC编码Thr密码子ACA四、高效表示目标基因战略和技术4/25/202350外源基因的原核表达专家讲座第50页共表示大肠杆菌稀有密码子tRNA基因

因为同义密码子使用频率与细胞内对应tRNA丰度有正比关系稀有密码子对应tRNA丰度很低，有可能在翻译过程中发生中止和移码突变。

处理这一问题方法：经过基因突变把稀有密码子改变为其它使用频率高同义密码子。在表示系统中共表示稀有密码子tRNA基因，以提升大肠杆菌细胞内稀有密码子tRNA丰度四、高效表示目标基因战略和技术4/25/202351外源基因的原核表达专家讲座第51页提升外源基因表示产物稳定性：大肠杆菌中含有各种蛋白水解酶，在外源基因表示产物诱导下，其蛋白水解酶活性可能会增加。所以必需提升外源蛋白在大肠杆菌细胞内稳定性。惯用方法有：1、将外源基因表示产物转运到细胞周质或培养基中；2、选取一些蛋白水解酶缺点株；3、对外源蛋白中水解酶敏感序列进行修饰或改造；4、在表示外源蛋白同时，表示外源蛋白稳定因子。4/25/202352外源基因的原核表达专家讲座第52页提升外源基因mRNA稳定性：大肠杆菌核酸酶系统能专一性地识别外源DNA或RNA并对其进行降解。为了保持外源mRNA在宿主细胞内稳定性，可采取两种办法：1、尽可能降低核酸外切酶对外源基因mRNA降解；2、改变外源基因mRNA结构，使之不易被酶降解。4/25/202353外源基因的原核表达专家讲座第53页提升目标基因mRNA和目标基因产物稳定性

因为大肠杆菌防御体系本身保护作用，大肠杆菌中核酸酶和蛋白水解酶能够降解目标基因mRNA和目标基因产物，这种降解作用程度对不一样基因或蛋白质而言是不一样，含有一定专一性和选择性。4/25/202354外源基因的原核表达专家讲座第54页提升目标蛋白稳定性办法主要有：利用蛋白转运系统把目标蛋白最终累积在周质空间，或分泌到培养基中采取缺乏一些蛋白水解酶基因缺点株作为宿主菌。对分子量较小目标基因进行融合表示或串联聚合表示。共表示能提升特定目标蛋白稳定性辅助因子，如分子伴侣基因。对蛋白质序列中蛋白水解酶敏感区域和识别位点进行改造。在较低温度下培养菌体和优化发酵条件。4/25/202355外源基因的原核表达专家讲座第55页

但必须指出是，因为目标蛋白本身性质和用途不一样，上述几个方法在使用上是受到一定限制。主要表现为：大肠杆菌对分子量较大目标蛋白较运和分泌效率普通比较低，不能满足大规馍制备需要。蛋白水解酶含量低菌株往往代谢不旺盛，生长速率慢，使高密度发酵比较困难。融合表示使目标蛋白构象与天然状态不一样，造成生物比活力降低，甚至没有活性。融合蛋白和串联聚合蛋白需要用酶或化学方法切割出单体目标蛋白。酶法成本比较高且加入酶蛋白还必须分离去除。化学法比酶法成本低，但不少裂解试剂有毒性。对蛋白质序列进行改造需要有基本蛋白质结构数据，而当前这方面数据库还不完整。4/25/202356外源基因的原核表达专家讲座第56页优化发酵过程：工艺优化生物学原因优化4/25/202357外源基因的原核表达专家讲座第57页工艺优化扩大培养条件优化反应器优化4/25/202358外源基因的原核表达专家讲座第58页生物学原因优化溶氧量pH值温度培养基成份培养基混合情况4/25/202359外源基因的原核表达专家讲座第59页四、高效表示目标基因战略和技术高密度发酵和工程化宿主细胞

大肠杆菌高密度发酵是大规模制备重组蛋白质过程中不可缺乏工艺步骤。其目标是在单个菌体对目标基因表示水平基本不变前提下，经过单位体积菌体数量成倍增加来实现总表示量提升。当前惯用发酵方式有：恒定培养、流加补料培养、连续培养三种

4/25/202360外源基因的原核表达专家讲座第60页构建出产乙酸能力低工程化宿主菌

高密度发酵后期因为菌体生长密度较高，培养基中溶氧饱和度往往比较低，氧气不足造成菌体生长速率降低和乙酸累积，乙酸存在对目标基因高效表示有显著阻抑作用。这是高密度发酵工艺研究中最迫切需要处理问题。即使在发酵过程中可采取通氧气，提升搅拌速度，控制补料速度等办法来控制溶氧饱和度，降低乙酸产生。但从实际应用上看，这些办法都有一定滞后效应，难以做到比较准确控制。所以构建出产乙酸能力低工程化宿主菌，是从恨本上处理问题路径之一。4/25/202361外源基因的原核表达专家讲座第61页芽孢杆菌表示系统芽孢杆菌是对人畜无害革兰氏阳性土壤微生物。细菌细胞壁内不含内毒素，能分泌大量蛋白到胞外，当前已成为一些主要工业酶制剂生产菌种。4/25/202362外源基因的原核表达专家讲座第62页1、多为非致病性微生物2、培养条件简单，生长快速3、表示产物能分泌到细胞外培养基中，且多数表示产物含有天然构象和生物学活性4、遗传背景比较清楚，便于进行遗传操作5、培养发酵技术比较成熟4/25/202363外源基因的原核表达专家讲座第63页芽孢杆菌表示系统不足1、芽孢杆菌分泌蛋白酶量大、种类多，对外源基因表示产物稳定性形成很大威胁2、载体不稳定，易造成外源基因丢失4/25/202364外源基因的原核表达专家讲座第64页芽孢杆菌表示载体复制子：当前广泛应用于芽孢杆菌表示载体复制子有：1、起源于金色葡萄球菌复制子如pUB110、pC194和pE194等质粒表示载体。2、起源于小芽孢杆菌复制子如pHY481、pWT481等。4/25/202365外源基因的原核表达专家讲座第65页芽孢杆菌表示载体开启子：在利用芽孢杆菌表示体系时，必需使用芽孢杆菌能够识别开启子。芽孢杆菌含有各种转录起始识别因子(σ)，在芽孢杆菌中已判定σ

已达十种。开启子可被特异σ

因子识别。芽孢杆菌开启表示含有显著时序性，与菌体生长周期和生理代谢活动亲密相关。4/25/202366外源基因的原核表达专家讲座第66页表示载体：1、自主复制质粒芽孢杆菌自主复制质粒大多为无抗性标志隐蔽质粒。带有抗性标志自主复制质粒主要来自其它革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌如pUB110、pC194和pE194，并在这些质粒基础上构建了双标识质粒等载体。自主复制质粒不稳定，在复制过程中易发生丢失。4/25/202367外源基因的原核表达专家讲座第67页2、整合质粒：在大肠杆菌质粒基础上增加一个芽孢杆菌抗性标志，以及待整合目标基因。因其没有芽孢杆菌复制子，不能自主复制，整合到芽孢杆菌染色体后，随细胞复制而复制。3、噬菌体：Φ105、SPβ及其它噬菌体均可作为芽孢杆菌表示载体。其中Φ105是一个温和噬菌体。4/25/202368外源基因的原核表达专家讲座第68页宿主菌：野生型芽孢杆菌能分泌大量胞外蛋白酶，影响外源基因表示产物稳定性，所以在构建芽孢杆菌表示系统宿主菌时要将蛋白酶基因进行突变，使其灭活或将活性降低。当前应用较多宿主菌主要有枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等。4/25/202369外源基因的原核表达专家讲座第69页枯草芽孢杆菌能分泌6种不一样胞外蛋白酶，即枯草杆菌蛋白酶、胞外蛋白酶、金属蛋白酶、杆菌肽酶及中性蛋白酶A和B。对其中3～5种胞外蛋白酶基因进行突变，可将胞外蛋白酶活性降低至原来1％；若将6种胞外蛋白酶基因全部突变，则胞外蛋白酶活性可降至原来0.3%左右。4/25/202370外源基因的原核表达专家讲座第70页短小芽孢杆菌表示体系优点：1、能对许多蛋白质进行分泌表示2、胞外蛋白酶活性较低3、短小芽孢杆菌分泌胞外蛋白酶同时还能产生蛋白酶抑制剂，不一样短小芽孢杆菌分泌抑制剂能力不一样，使胞外蛋白酶活性差异很大4/25/202371外源基因的原核表达专家讲座第71页4、细胞壁结构由三层组成，最外两层为蛋白层，内层为肽聚糖。细胞壁结构与细胞生长周期相关。在生长稳定前期，细胞壁外层和中层蛋白开始从细胞表面脱落，分泌型蛋白开始表示；进入稳定时后，细胞壁蛋白层全部脱落，细胞壁蛋白依然表示造成细胞壁蛋白在培养基中大量累积。4/25/202372外源基因的原核表达专家讲座第72页5、利用细胞壁蛋白基因开启区、操纵区、翻译起始区和蛋白质信号肽序列等元件表示外源基因，可使外源基因在小芽孢杆菌表示系统中取得高效分泌表示。4/25/202373外源基因的原核表达专家讲座第73页芽孢杆菌中高效表示策略1、提升表示质粒在细胞中稳定性：以金黄色葡萄球菌为基础构建一系列质粒在进行滚环复制时会产生许多单链DNA，这些单链DNA存在会对质粒DNA造成影响，在没有选择压力情况下易发生丢失；一些表示质粒载体还含有染色体DNA同源序列，在细胞分裂过程中可发生同源交换，造成质粒消失。4/25/202374外源基因的原核表达专家讲座第74页2、构建新型表示质粒：经过消除表示载体中与宿主菌染色体DNA同源序列3、构建整合型质粒：利用质粒中与染色体同源序列构建整合型质粒，使目标基因整合到染色体上4、灭活芽孢杆菌胞外蛋白酶4/25/202375外源基因的原核表达专家讲座第75页链霉菌表示系统链霉菌是一类好氧、丝状革兰氏阳性细菌，广泛存在于土壤中，能够产生各种生理活性物质。链霉菌染色体为线状结构，在中间含有复制起始点和共价结合末端蛋白，DNA不稳定，有时会出现缺失而环化，但对细菌生长没有严重影响。4/25/202376外源基因的原核表达专家讲座第76页链霉菌表示系统特点；1、为非致病性细菌，不产生内毒素2、可进行外源蛋白分泌表示3、可进行高密度培养，含有丰富次级代谢路径和初、次级代谢调控体系，表示外源蛋白时间较长4、链霉菌在传统发酵工业中应用历史悠久，有良好工业化基础4/25/202377外源基因的原核表达专家讲座第77页链霉菌表示载体开启子：链霉菌基因开启子结构表现为多样性，最少存在三类链霉菌基因开启子：1、与大肠杆菌基因－10区和－35区类似开启子，－10区碱基序列通常为5’TAGPuPuT3’，－35区碱基序列为5’TTGCPu3’，这种开启子序列可被大肠杆菌RNA聚合酶识别，这类开启子普通在细菌对数生长久开启相关基因转录。4/25/202378外源基因的原核表达专家讲座第78页2、仅与大肠杆菌基因－10区类似开启子。3、与大肠杆菌基因－10区与－35区序列均不相同开启子。终止子：链霉菌基因终止子结构含有较长不完全互补反向重复序列，能形成发卡结构，在多数情况下不含寡聚T序列，转录终止位点位于终止子结构下游邻近区域4/25/202379外源基因的原核表达专家讲座第79页核糖体结合位点：链霉菌基因核糖体结合位点序列类似于其它原核生物SD序列：5’(a/g)GGAGG3’相对于其它革兰氏阳性细菌而言，链霉菌基因中核糖体序列保守性略低，与起始密码之间距离为5～12个碱基。链霉菌基因转录起始位点与编码区之间距离改变也较大，从数个bp到几百个不等。4/25/202380外源基因的原核表达专家讲座第80页密码子：链霉菌对编码蛋白质密码子含有显著偏爱性。对数十种链霉菌蛋白质密码子进行统计发觉，编码蛋白质碱基序列中GC平均含量高达73％，密码子第一、第二和第三位碱基GC含量分别为66％、53％和93％。有些简并密码子使用频率不足2％。4/25/202381外源基因的原核表达专家讲座第81页链霉菌表示载体1、高拷贝载体：普遍采取是pIJ101，在链霉菌中拷贝数为40～800。通常加入硫链丝霉素、红霉素、紫霉素和新霉素作为抗性选择性标识。pIJ702是pIJ101衍生质粒，含有mel(酪氨酸酶)和tsr基因作为选择性标识。外源基因可插入灭活mel基因，因不产生黑色素而非常方便使用。4/25/202382外源基因的原核表达专家讲座第82页2、低拷贝载体：由SCP2*衍生质粒pIJ922和940等，可接收较大外源基因，但只有1～2个拷贝。3、穿梭质粒载体：可在大肠杆菌中完成构建和复制，在链霉菌细胞中进行表示。4、噬菌体载体4/25/202383外源基因的原核表达专家讲座第83页宿主菌：链霉菌基因表示系统宿主菌主要有变铅青链霉菌和天蓝色链霉菌。天蓝色链霉菌是整个霉菌中分子遗传学研究最清楚菌株，但有较强修饰系统，因而在实际应用中都是以变铅青链霉菌作为外源基因表示受体菌系统。4/25/202384外源基因的原核表达专家讲座第84页变铅青链霉菌表示外源基因优点1、遗传背景清楚，不含内源性质粒2、对外源DNA无显著修饰作用3、能够高效表示链霉菌基因以外其它基因；4、含有高效异源蛋白分泌系统，而且其内源蛋白酶和外源蛋白酶合成量低。4/25/202385外源基因的原核表达专家讲座第85页在链霉菌中高效表示外源基因策略影响外源基因在链霉菌中表示原因包含：开启子特征信号肽序列基因结构和发酵条件等4/25/202386外源基因的原核表达专家讲座第86页开启子影响：链霉菌RNA聚合酶能识别一些原核生物开启子，但不能识别真核生物基因开启子，所以表示真核生物基因时要采取链霉菌开启子。为高效表示要对其进行适当修饰和改造。如在开启子－10区和－35区内插入GC碱基对可显著提升外源基因转录效率；将ermE开启子中缺失3个碱基对，可使基因开启转录效率大大增加。4/25/202387外源基因的原核表达专家讲座第87页信号肽序列：针对要表示外源蛋白对信号肽序列进行优化是实现外源蛋白高效分泌表示主要路径。在信号肽N－区电荷数增加或降低可使分泌表示效率成倍增加或降低；信号肽与目标蛋白距离也影响到外源蛋白分泌。信号肽只影响分泌是否而不影响表示效率。4/25/202388外源基因的原核表达专家讲座第88页基因结构影响：1、密码子影响：应尽可能不出现链霉菌中稀有密码子。链霉菌中翻译起始密码子普通为ATC或GTC,终止密码为TAA或TAG。2、SD序列：不一样宿主其SD序列不一样，针对不一样链霉菌对SD序列进行改造或修饰以提升外源基因表示。4/25/202389外源基因的原核表达专家讲座第89页3、终止子：选择适当终止子可提升RNA聚合酶利用率和增加mRNA稳定性发酵条件：包含发酵工艺、培养基组分、各种环境原因如温度、pH值和溶氧等一系列相关条件，这些条件确实定须经试验重复探索。4/25/202390外源基因的原核表达专家讲座第90页蓝藻表示系统蓝藻是近年来快速发展起来一个很好表示系统，蓝藻含有叶绿素和藻胆色素，含有光合系统，进行光合作用。蓝藻还含有原核生物特征，无细胞核及双层膜结构细胞器，染色体DNA裸露，是经典原核生物。4/25/202391外源基因的原核表达专家讲座第91页蓝藻表示系统特点作为表示外源基因受体菌兼具微生物和植物优点，表现为：1、基因组为原核型，除了裸露染色体DNA外，不含叶绿体DNA和线粒体DNA，遗传背景简单，便于基因操作和外源DNA检测；2、细胞壁为革兰氏阴性，便于外源DNA转化；4/25/202392外源基因的原核表达专家讲座第92页3、营光合自养生长，培养条件简单，只需光、CO2、无机盐、水和适宜温度；4、各种蓝藻含有内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极好条件；5、蓝藻富含蛋白质，而且多数蓝藻无毒，经常作为食品或保健品添加剂。4/25/202393外源基因的原核表达专家讲座第93页蓝藻外源基因表示载体为使外源目标基因有效转化及表示，已构建了一系列穿棱质粒表示载体和基因整合平台系统，如：pZL、pPKE2、pPKET等。在这些表示载体上组装了各种含有不一样开启子基因表示盒。应用较多有噬菌体PL和PR开启子及蓝藻藻蓝蛋白cpcB2A2操纵子开启子和热休克基因groESL等。4/25/202394外源基因的原核表达专家讲座第94页在蓝藻细胞中高效表示外源目标基因策略1、构建在蓝藻细胞中稳定性好表示载体系统：现已构建了松驰质粒复制起始点穿梭质粒，在细胞中有较高基因拷贝数，提升了目标基因高效表示可能性。4/25/202395外源基因的原核表达专家讲座第95页2、重组穿梭质粒在蓝藻细胞中通常是很不稳定，在缺选择压力培养条件下很轻易丢失，造成目标基因表示不稳定性。近年来以蓝藻染色体DNA非必需序列区为基因整合平台，构建对应供体质粒表示载体，经过同源重组将目标基因整合到蓝藻染色体上确保其稳定。4/25/202396外源基因的原核表达专家讲座第96页3、组装含强开启子外源表示盒。4、外源基因融合表示：近年来开发了泛素融合表示系统。经蓝藻、大肠杆菌及酵母细胞试验证实，目标基因泛素基因融合表示可大大提升目标基因表示量，而且几乎全部泛素融合形式产生蛋白质都是含有活性，同时，泛素还可被作为分离标签。4/25/202397外源基因的原核表达专家讲座第97页基因表示产物检测与分离纯化外源基因表示包含转录和翻译两个阶段。所以，外源基因表示产物检测过程就是对特异性mRNA和蛋白质检测。对mRNA检测主要方法为Northern杂交法，检测特异性蛋白质方法包含生化反应检测法、免疫学检测法和生物学活性检测法等。4/25/202398外源基因的原核表达专家讲座第98页外源基因转录产物检测外源基因转移到受体细胞后可能有命运是：1、外源基因与表示载体一起游离于染色体外进行转录2、外源基因整合到染色体上并进行转录3、外源基因整合到染色体上后不转录，表现为基因缄默4/25/202399外源基因的原核表达专家讲座第99页Northern杂交检测mRNA步骤：1、提取总RNA2、分离mRNA(利用亲和层析原理纯化)3、制备RNA探针。(依据mRNA序列合成同源DNA探针或以cDNA探针)4、Northern杂交4/25/2023100外源基因的原核表达专家讲座第100页汇报基因酶法检测汇报基因特点1、表示产物及其功效在未转化受体细胞中不存在2、汇报基因表示产物便于检测4/25/2023101外源基因的原核表达专家讲座第101页基因工程中使用汇报基因：1、氯霉素乙酰转移酶(CAT)：催化乙酰辅酶A中乙酰基团转移到氯霉素分子上而使氯霉素失活。真核生物细胞中不含CAT，重组后细胞产生氯霉素抗性。CAT活性能够经过反应底物乙酰CoA降低或乙氯霉素增加表示。4/25/2023102外源基因的原核表达专家讲座第102页基因工程中使用汇报基因：2、β-葡萄糖苷酯酶基因(GUS)编码产物催化β-葡萄糖苷酯类物质水解。大多数植物细胞、细菌细胞和真菌中都不存在内源GUS活性而广泛用作转基因植物、细菌和真菌汇报基因。另外惯用汇报基因有二氢叶酸还原酶、胸苷激酶、荧光素酶等4/25/2023103外源基因的原核表达专家讲座第103页免疫学检测：是基因表示产物检测中最惯用方法之一。以表示产物作为抗原，经过与特异性抗体发生反应来确定基因表示情况。主要方法有1、免疫沉淀法2、酶联免疫吸附法3、Westhern印迹法4、固相放射免疫法等4/25/2023104外源基因的原核表达专家讲座第104页免疫沉淀法过程1、对靶细胞进行放射性标识：通常以同位素35S标识靶蛋白，在培养基中加入〔35S〕蛋氨酸和半胱氨酸混合物，经过代谢过程使哺乳动物培养细胞标识上放射性同位素。2、细胞裂解释放靶抗原3、靶蛋白免疫沉淀将抗靶蛋白特异性抗体加入到细胞裂解液中形成抗原-抗体复合物并回收。4/25/2023105外源基因的原核表达专家讲座第105页4、将回收靶蛋白在反应试管中与蛋白抗体，使之与靶蛋白结合并形成沉淀。5、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析4/25/2023106外源基因的原核表达专家讲座第106页酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)1、抗体制备：ELISA检测中抗体包含普通抗体和酶标识抗体，其中酶标识抗体又分为针对特异抗原酶标一抗和针对一抗酶标二抗2、抗体或抗原包被：经过物理吸附法和共价交联法等将抗原或抗体固定在固相载体表面4/25/2023107外源基因的原核表达专家讲座第107页3、免疫反应：特异性抗原与固相抗体结合形成抗原-抗体复合物，再与酶标抗体反应形成抗原-抗体-酶标抗体复合物4、特异性表示产物检测：洗去未发生反应抗体，加入显色剂或荧光底物，经过酶促反应发生颜色或荧光强度改变以确定抗原量。4/25/2023108外源基因的原核表达专家讲座第108页Westhern印迹法1、总蛋白质提取2、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳3、蛋白质印迹4、探针制备(针对目标蛋白抗体［一抗］它普通不进行标识，而与一抗结合二抗带特定标识)5、杂交检出生物学活性检测4/25/2023109外源基因的原核表达专家讲座第109页基因表示产物分离纯化1、细胞破碎2、离心3、特异性表示蛋白初步分离4、柱层析5、电泳分离