兽药残留量的检验要点

本资料起源兽药残留量的检验要点第1页4.1兽药与兽药残留（研究背景、兽药残留产生原因、类型、危害）4.2水产品中氯霉素检验（对虾中氯霉素含量竞争性ELISA法检测）4.3猪组织中盐酸克伦特罗检验

（猪组织中盐酸克伦特罗GS/MS法检测、猪组织中盐酸克伦特罗ELISA法检测）第四章兽药残留量检验

内容关键点：兽药残留量的检验要点第2页

兽药：预防和治疗畜禽疾病药品；促进生长、提升生产性能、改进动物性食品品质；也包含一些化学、生物动物保健品或饲料添加剂。当代化动物集中喂养，经常需要使用抗生素或其它药品来控制可能暴发疾病，同时有效使用兽药能够在很大程度上提升动物对饲料利用率。4.1

兽药与兽药残留1、研究背景兽药残留量的检验要点第3页1、研究背景

兽药使用极易造成动物源食品中有害物质残留，尤其是因为养殖人员对科学知识缺乏以及一味地追求经济利益，致使滥用兽药现象在畜牧业中普遍存在。

兽药残留：“兽药在动物源食品中残留”简称，是指动物产品任何可食部分所含兽药母体化合物及（或）其代谢物，以及与兽药相关杂质。兽药残留直接危害人体健康，影响畜牧业发展和生态环境。伴随人们对动物源食品由需求型向质量型转变，兽药残留已逐步成为全世界关注一个焦点。兽药残留量的检验要点第4页

抗生素类：氯霉素、四环素、土霉素、青霉素等；磺胺类：磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶等；呋喃类：呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等；激素和β-兴奋剂：盐酸克伦特罗、己烯雌酚、孕酮等；抗寄生虫类：左旋咪唑、苯丙咪唑、克并咪唑、克球酚、吡喹酮等。2、兽药残留类型兽药残留量的检验要点第5页

非法使用违禁或淘汰药品；不恪守休药期要求；滥用药品；违反相关标签要求；屠宰前用药。3、兽药残留产生原因兽药残留量的检验要点第6页

毒性损害;

引发过敏反应；造成病原菌产生耐药性;

破坏微生态平衡，造成二重感染;

致畸、致癌、致突变作用;

影响生态环境；影响畜牧业发展。4、兽药残留危害兽药残留量的检验要点第7页

筛选方法

检测和确认方法：理化检验技术（GC、HPLC、TLC、GC-MS、HPLC-MS等）。微生物检验（微生物抑制试验）免疫法（免疫检测试剂盒）阳性5、兽药残留分析方法兽药残留检验分析方法包含筛选、检测和确认。兽药残留量的检验要点第8页GC灵敏度较高，但易出现假阳性、阳性结果需深入确证；HPLC操作简单，但灵敏度不高；ELISA简单、快速、灵敏度，但轻易产生假阳性，普通只适用进行样品粗筛，阳性结果需进行确证；当前灵敏度较高、确证率很好是GC/MS、GS-MS/MS

。5、兽药残留分析方法兽药残留量的检验要点第9页

氯霉素（chloramphenicol，CAP）是由委内瑞拉链丝菌产生一个光谱抗生素。CAP对造血系统有毒性反应，是一个禁用药。4.2.1

概述

氯霉素检测方法主要有：微生物筛选法、GC（ECD）、HPLC（UV）、GC-MS、GS-MS/MS、ELISA以及RIA等。4.2

水产品中氯霉素检验兽药残留量的检验要点第10页

酶联免疫吸附试验（ELISA）竞争性ELISA法基本原理竞争性ELISA法检测对虾中氯霉素含量试验设计

（课程试验）分析和讨论4.2.2对虾中氯霉素含量竞争性ELISA法检测兽药残留量的检验要点第11页1、酶联免疫吸附试验（ELISA）4.2.2对虾中氯霉素含量竞争性ELISA法检测

免疫检测技术是以抗原抗体特异性、可逆性结合反应为基础，结合一些生化或物理方法作为信号显示或放大系统而建立测定方法。

酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linkedimmunosorbentassay,ELISA）是把抗原抗体免疫反应和酶高效催化有机地结合起来一个免疫检测技术，其基础是抗原与抗体固相化及抗原或抗体酶标识。兽药残留量的检验要点第12页1、酶联免疫吸附试验（ELISA）兽药残留量的检验要点第13页基本原理：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶活性；结合物与对应抗原或抗体反应后，结合酶仍能催化底物生产有色物质生成，而颜色深浅可定量抗体或抗原含量。1、酶联免疫吸附试验（ELISA）兽药残留量的检验要点第14页图4-2竞争性酶联免疫吸附试验法测抗原基本原理示意图2、竞争性ELISA基本原理（以竞争性ELISA法测定氯霉素抗原为例）兽药残留量的检验要点第15页

酶标抗原与样品或标准体中非标识抗原（氯霉素）含有相同与抗体结合能力，二者竞争与固相载体包被抗体结合。洗涤多出酶标抗原，加酶反应底物显色后依据颜色深浅进行定量。在整个反应该中，样品中氯霉素含量越多，反应显色就越淡。反之，样品中氯霉素含量越少，则显色越深。2、竞争性ELISA基本原理（以竞争性ELISA法测定氯霉素抗原为例）为何样品中氯霉素含量与显色呈反比？兽药残留量的检验要点第16页

试验方案设计：为了到达某种特定目标，使用各种试验试剂、仪器和设备，按照可行试验原理，列出试验操作次序、确定各步骤操作方法，列出必须注意事项。3、竞争性ELISA检测对虾中氯霉素含量试验设计4.2.2对虾中氯霉素含量竞争性ELISA法检测兽药残留量的检验要点第17页1）试验目标：深入学习酶联免疫试验法基本原理和试验方法，确实掌握酶联免疫吸附试验法测定虾肉中氯霉素含量基本原理、试验方法和结果分析。3、竞争性ELISA检测对虾中氯霉素含量试验设计4.2.2对虾中氯霉素含量竞争性ELISA法检测兽药残留量的检验要点第18页图4-2竞争性酶联免疫吸附试验法测抗原基本原理示意图2）试验原理3、竞争性ELISA检测对虾中氯霉素含量试验设计兽药残留量的检验要点第19页

氯霉素检测试剂盒4.2.2对虾中氯霉素含量竞争性ELISA法检测

氯霉素检测试剂盒组成：微量测试孔；氯霉素标准溶液；10倍浓缩萃取稀释液；10倍浓缩洗涤液；氯霉素酶标识物；底物溶液；反应终止液。3、竞争性ELISA检测对虾中氯霉素含量试验设计3）主要试剂：氯霉素酶联免疫检测试剂盒。兽药残留量的检验要点第20页4）主要仪器：简易萃取设备、氮吹仪、离心机、酶标分析仪。3、竞争性ELISA检测对虾中氯霉素含量试验设计4.2.2对虾中氯霉素含量竞争性ELISA法检测图4-2

酶标仪兽药残留量的检验要点第21页4、试验步骤（1）试验准备从冰箱取出试剂盒，将氯霉素标准溶液、浓缩萃取稀释液、浓缩洗涤液、酶标识物、底物溶液及微量测试孔条置于室温下回温30min。配制原倍萃取稀释液及洗涤液：用蒸馏水将10倍浓缩萃取稀释液及浓缩洗涤液分别按1:9百分比稀释。4.2.2对虾中氯霉素含量竞争性ELISA法检测兽药残留量的检验要点第22页（2）样品制备将3g虾肉剪碎后放入50mL带塞离心管中，加入6mL乙酸乙酯，用均质机均质约1min，再震荡约30s。离心（3000rpm，10min），取2mL上清液至玻璃管中，于50℃下氮气吹干。于上述玻璃管中加入正己烷2mL，先将残余物完全溶解后，再加入1mL原倍萃取稀释液，震荡约30s。离心（3000rpm，10min），用吸管吸去上层液及中间乳化层部分，弃掉，取下层液备用。若乳化现象较严重，则先将大部分上层液取出后，再将玻璃管置入80℃水中，隔水加热约5～10min。4.2.2对虾中氯霉素含量竞争性ELISA法检测兽药残留量的检验要点第23页（3）操作步骤

取一定微量测试孔条，于适当微孔中分别加入100μL标准溶液。在另外微孔中加入100μL已完成前处理样品溶液。在每一微孔中加入50μL酶标识物。轻敲盘子四面，使其充分混合后室温下避光静置温育1h。甩掉反应液，再将洗液加满每一微孔后甩掉，重复3次。最终一次甩掉洗液后，在吸水纸上拍干。每一微孔中加入底物溶液100μL，轻敲盘子四面。于室温下避光静置温育20min。于每一微孔中加入100μL反应终止液，用酶标仪于波长450nm下判读。4.2.2对虾中氯霉素含量竞争性ELISA法检测兽药残留量的检验要点第24页5、结果处理所测得标准吸光值和样品吸光值（B）除以第一个标准（零标准）吸光值（B0）再乘以100。以B/B0百分数值为纵坐标，以标样浓度（ppb）为横坐标，绘制标准半对数曲线。依据每个样品B/B0百分数值就可从曲线上读出相对应样品浓度（ppb）。依据标准曲线所得出样品浓度乘以样品稀释倍数计算出样品中氯霉素实际浓度，最终结果用“μg/kg”单位表示。4.2.2对虾中氯霉素含量竞争性ELISA法检测兽药残留量的检验要点第25页6、注意事项使用前先将取出置于室温下，回温30min。回温后，取出所需微量测试孔条，将剩下板条马上放回铝箔袋中用胶带封好，置于4℃保留。浓缩萃取稀释液和浓缩洗涤液使用前必须稀释。每次吸收不一样液体时一定要换移液枪吸头。加样时必须小心勿溅出微孔外，以免造成其它微孔污染，加样品或试剂时枪头请勿接触微孔，不可产生气泡。洗涤必须充分，重复3次。温育时，要盖上塑料片或标签纸，置于暗处，温育时间不够不要随意取出；显色后尽快比色。试剂盒较贵且量极少，准确量取，不要造成浪费。兽药残留量的检验要点第26页7、分析与讨论酶联免疫吸附试验检测试剂盒应该怎样选择？加底物进行温育反应后不显色原因？洗涤不彻底会对结果产生怎样影响？为何？标准曲线偏离（线性不好，包含斜率偏大和偏小）原因有哪些？样品吸光值高于标准吸光值原因？4.2.2对虾中氯霉素含量竞争性ELISA法检测兽药残留量的检验要点第27页

盐酸克伦特罗（clenbuterol，CLB）是一个选择性β2-肾上素受体激动剂（简称β-兴奋剂），是国家按兴奋剂管理药品，为人、畜呼吸系统药品（氨哮素、克喘素）。α-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇盐酸盐

4.3.1

盐酸克伦特罗概述

盐酸克伦特罗可促进动物生长，加速脂肪转化，提升瘦肉率，被俗称为“瘦肉精”。4.3猪组织中盐酸克伦特罗检验兽药残留量的检验要点第28页4.3.1

盐酸克伦特罗概述

盐酸克伦特罗加速脂肪转化？胰高血糖素促甲状腺激素cAMP脂肪酶激活激活兽药残留量的检验要点第29页

非法使用盐酸克伦特罗作为饲料添加剂，使用量大（是治疗剂量5-10倍），使用时间长（连续添加时间普通3周以上），代谢慢，因而轻易在动物体内（尤其是眼、肺、肝、肾）残留。盐酸克伦特罗经过食物链进入人体，产生蓄积中毒，如头晕、乏力、心律失常等。所以，国内外已经禁止β-肾上腺素激动剂在动物生产中应用。4.3.1

盐酸克伦特罗概述兽药残留量的检验要点第30页

克伦特罗检验方法：HPLC、GC-MS、毛细管区带电泳法和免疫分析法。

感官识别：健康肉淡红色，肉质弹性好，无“出汗”现象；“问题肉”尤其鲜红，脂肪非常薄，瘦肉纤维疏松，有“出汗”现象。4.3.1

盐酸克伦特罗概述

GB/T5009.192-《动物性食品中克伦特罗残留量测定》，提出了从ELISA筛选、HPLC定量到GC-MS确证和定量对动物性食品中克伦特罗残留量进行监测。兽药残留量的检验要点第31页4.3.2猪组织中盐酸克伦特罗检验—GS/MS法

基本原理：固体样品剪碎，用高氯酸溶液匀浆。若为液体试样，则加入高氯酸溶液，进行超声加热提取，用异丙醇+乙酸乙酯（40+60）萃取，有机相浓缩，经弱阳离子交换柱进行分离，用乙醇+浓氨水（98+2）溶液洗脱，洗脱液浓缩，经N,O-双三甲级硅烷三氟乙酰胺衍生后于气质联用仪上进行测定，以美托洛尔为内标，进行定量。GB/T5009.192-《动物性食品中克伦特罗残留量测定》第一法——GC/MS法。兽药残留量的检验要点第32页4.3.3猪组织中盐酸克伦特罗检验—ELISA法

基本原理：微孔板包被有针对克伦特罗IgG抗抗体；加入克伦特罗抗体，经过温育和洗涤后；加入酶标识物、标准或样品溶液，克伦特罗与酶标识物竞争与抗体结合；没有连接克伦特罗酶标识物在被洗涤除去；加入酶底物和发色剂而且温育，结合酶标识物将无色发色剂为蓝色产物，加入反应终止液使颜色有蓝转变为黄色。在450nm处比色测定。GB/T5009.192-《动物性食品中克伦特罗残留量测定》第三法——GC/MS法。兽药残留量的检验要点第33页

酶联免疫试验设计4.3.3猪组织中盐酸克伦特罗检验——ELISA法兽药残留量的检验要点第34页4.3.3猪组织中盐酸克伦特罗检验——ELISA法

试验关键操作：

试剂盒选择和准备；试样处理；加样；洗涤；比色。兽药残留量的检验要点第35页1）试剂盒选择和准备固相载体：吸附性能，孔底透明度，板、孔性能差异；包被物：纯度；储存条件：2-