生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究

生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第1页研究背景迟缓性心律失常为临床常见多发病电子起搏器植入术是治疗严重迟缓性心律失常首选方案生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第2页电子起搏器存在缺点非生理性起搏电池寿命有限易受外界电磁干扰等生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第3页生物起搏器构建--当前研究热点生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第4页主要内容生物起搏器种子细胞筛选HCN通道电生理及药理学试验研究生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第5页第一个别

生物起搏器种子细胞筛选生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第6页研究对象心脏干细胞（CSCs）脂肪干细胞（ASCs）骨髓间充质干细胞（BMSCs）生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第7页CSCs相关研究生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第8页研究内容CSCs分离培养及其判定5-氮杂胞苷诱导CSCs向窦房结样细胞分化生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第9页试验方法生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第10页小园形、亮细胞从组织移植块中爬出（箭头所表示）（×200）

生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第11页流式细胞仪分选左图，分选前流式细胞仪检测培养细胞c-kit阳性率右图，用流式细胞仪分选经c-kit标识细胞生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第12页流式细胞仪检测流式细胞仪判定分选后CD34、CD45阳性率生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第13页倒置显微镜观察分选后单个细胞（左图），培养后簇集式增殖、心球样细胞团形成（右图）（×200）生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第14页荧光显微镜观察在光学显微镜下(左图)、荧光显微镜下（右图）观察刚分选同一批c-kit+细胞（×400）生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第15页增殖能力比较不一样部位间比较生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第16页增殖能力比较不一样性别间比较生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第17页免疫荧光检测分选后4周用抗cTnI,SMAandCD31抗体检测培养细胞免疫表型（A,×300;B-C,×200）ACB生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第18页RT-PCR检测生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第19页RT-PCR检测RT-PCR方法分析分选细胞不一样培养时间GATA-4,HCN2和HCN4mRNA表示*P<0.05,#P<0.01,培养8周组vs培养4周组

生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第20页免疫荧光检测5-Aza诱导CSCs分化用抗cTnI,GATA4抗体检测经5-Aza诱导后CSCs分化免疫表型（A,×200;B,×400）生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第21页免疫荧光检测用抗HCN4抗体检测经5-Aza诱导后CSCs分化细胞表示HCN4蛋白情况（A,×400;B,×200）生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第22页荧光检测结果比较不一样浓度5-aza诱导后细胞在4周时表示GATA-4,cTnI和HCN4蛋白情况.10uM组与前两组比较，#P<0.055-Aza诱导浓度生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第23页RT-PCR检测RT-PCR技术分析在不一样浓度5-aza诱导后细胞在不一样培养时间GATA-4,HCN2和HCN4mRNA表示生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第24页RT-PCR检测RT-PCR技术分析在不一样浓度5-aza诱导后培养细胞在不一样培养时间GATA-4,HCN2和HCN4mRNA表示.ΔP<0.05,#P<0.01,2组vs3组或4组

生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第25页结论体外培养条件下能够取得c-kit+CD34-CD45-CSCs不一样部位不一样性别起源CSCs增殖能力存在差异生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第26页c-kit+CSCs含有向心肌样和窦房结样细胞分化能力10µM5-Aza有增强上述分化作用生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第27页ASCs与BMSCs相关研究生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第28页试验流程ASCsBMSCs细胞形态学流式细胞仪检测细胞表面标识物增殖能力比较5-AZa诱导cTnI阳性率比较HCN4mRNA相对含量检测倒置显微镜观察、拍照CD29、CD44CD73、CD14CD34转染HCN4基因CCK-8试剂盒转染效率凋亡率生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第29页形态学比较（P5）(×200)ASCsBMSCs生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第30页表面标识物检测（P5）抗原表示水平无显著差异生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第31页增殖能力比较*

P<0.05**P<0.01

ASCs体外扩增能力强于BMSCs且P15仍保持较高增殖能力生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第32页ASCs和BMSCs向心肌细胞分化能力比较（P5）(×400)犬ASCs心肌样分化能力强于BMSCsaASCsbBMSCsc二者对比生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第33页RT-PCR检测加入5-AZa后ASCs与BMSCsHCN4mRNA表示aASCsbBMSCsc二者对比各个时间点ASCs中HCN4mRNA表示量均高于BMSCs生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第34页ASCs和BMSCs转染HCN4效率比较（×400）aASCsbBMSCsc二者对比P5代ASCs与BMSCs转染效率无显著统计学差异P>0.05（×400）生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第35页ASCs和BMSCs转染HCN4后凋亡率比较aASCsbBMSCsc二者对比P5代ASCs转染HCN基因后凋亡率低于BMSCsP<0.05生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第36页结论来自同一个体ASCs与BMSCs相比含有更强体外增殖能力含有更强向心肌样细胞及窦房结样细胞分化能力二者基因转染效率相同，但转染HCN4基因后ASCs凋亡水平更低生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第37页第二个别HCN通道电生理及药理学试验研究生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第38页主要内容HCN通道在卵母细胞中表示HCN2/HCN4通道复合体转染ASCs胺碘酮对HCN通道作用及机制生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第39页HCN通道在卵母细胞中表示生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第40页爪蟾卵母细胞HCN通道基因分离扩增、酶切、线性化培养体外转录细胞内显微注射通道表示卵母细胞钳统计通道电流试验流程生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第41页电生理学指标电流表示幅值通道动力学特征生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第42页HCN通道电流

A.HCN1电流B.HCN2电流C.HCN4电流D.激活曲线生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第43页HCN通道动力学A.经典电流B.I-V曲线C.去激活常数D.激活常数生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第44页

HCN1/HCN2共表示形成电流幅值

生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第45页HCN1/HCN4共表示形成电流幅值

生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第46页HCN2/HCN4共表示形成电流幅值生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第47页HCN1/HCN2与单个亚型通道动力学比较

A.电流图B.激活时间常数C.激活曲线生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第48页HCN1/HCN4与单个亚型通道动力学比较A.电流图B.激活时间常数C.激活曲线生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第49页HCN2/HCN4与单个亚型通道动力学比较A.电流图B.激活时间常数C.激活曲线生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第50页结论HCN1、2和4共表示后均可形成复合体电流HCN2/4以1:1百分比共表示所形成复合体电流幅度最大，激活速度最快生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第51页HCN2/HCN4通道复合体转染ASCs生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第52页试验流程共聚焦摄影ASCs细胞培养构建荧光标识基因质粒转染细胞固定提取RNART-PCR检测抽提蛋白Westernblot爬片通道电流统计生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第53页共转染HCN2/4通道

生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第54页通道mRNA表示水平

生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第55页通道蛋白表示水平

生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第56页封接带荧光ASCs细胞

×200生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第57页膜片钳统计HCN电流生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第58页通道动力学研究激活常数激活曲线生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第59页结论HCN2及HCN4通道可分布在ASCs细胞膜共同区域二者共表示存在促进作用HCN2/HCN4通道复合体表示在ASCs上与表示在爪蟾卵母细胞上电生理学特征一致较单一亚型含有更加快激活动力学特征

生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第60页胺碘酮对HCN通道作用及机制

生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究第61页胺碘酮对HCN通道浓度依赖性阻滞