细菌内毒素工作标准品效价标定方法研究

细菌内毒素工作标准品效价标定方法研究

Summary：根据《中国药典》2020年版通则1143细菌内毒素检查法，工作标准品应该用法定标准品进行标定。探究了运用凝胶法对细菌内毒素工作标准品效价进行标定的检测方法，使用购于中国食品药品检定研究院，效价为9000EU/支细菌内毒素国家标准品（CSE）标定标示效价为10EU/支的细菌内毒素工作标准品（WSE）。通过试验，检验结果均符合《中国药典》现行版的要求。Keys：细菌内毒素国家标准品，细菌内毒素工作标准品，鲎试剂，凝胶法，效价引言：根据《中国药典》先行版收载的细菌内毒素检查法要求，根据实际使用要求，使用细菌内毒素国家标准品来标准定CSE的效价，可以用凝胶法或光度法进行标定，本企业实际日常检验中，使用多个灵敏度的鲎试剂则采用两个不同灵敏度的鲎试剂标定CSE的效价。若标定的CSE效价Pt，结果0.5Pe≤Pt≤2Pe（细菌内毒素工作标准品标示效价（Pe））。则按照标示效价使用。正文：1.实验材料1.1仪器设备仪器设备名称型号生产厂家净化工作台SW-CJ-1FD苏州净化ET-96内毒素凝胶法测定仪ET-96天津市天大天发科技有限公司电热恒温干燥箱DL-201BS天津市中环实验电炉有限公司ZH-2型自动旋涡混合器ZH-2上海安谱科学仪器有限公司1.2试剂试药验证用试剂厂家批号灵敏度（λ）/规格鲎试剂湛江安度斯生物有限公司21041512

0.03EU/ml鲎试剂湛江安度斯生物有限公司210611120.25EU/ml细菌内毒素工作标准品湛江安度斯生物有限公司191010110EU/支细菌内毒素国家标准品中国食品药品检定研究院150800-2016019000EU/支细菌内毒素检查用水湛江安度斯生物有限公司200804050ml2.实验准备2.1玻璃器皿的洗涤将检验所用玻璃器皿放入洁洁灵水中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用纯化水反复冲洗三遍以上，晾干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置电热恒温干燥箱中。2.2除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置烤箱后将烤箱调至250℃，待烤箱温度升至设定的温度后开始记时，需干烤至少2小时。达到规定时间后，关断电源。待烤箱温度自然降至室温，在不开启金属容器的情况下，可以保存24小时，否则需再次灭菌除去可能存在的外源性内毒素。2.3细菌内毒素国家标准品溶液的制备取细菌内毒素国家标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕,75％酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。用移液器（100-1000μL）吸取BET水1ml放入细菌内毒素国家标准品瓶中,或按标准品使用说明书用移液器加入规定量的BET水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟，然后根据鲎试剂标示灵敏度（λ1为0.25EU/ml标示灵敏度、λ2为0.03U/ml标示灵敏度）），将细菌内毒素国家标准品稀释制备成所需浓度的细菌内毒素标准溶液即0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.0625EU/ml和0.0625EU/ml、0.03125EU/ml、0.15625EU/ml、0.078125EU/ml。每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒。只有当细菌内毒素国家标准品的2λ平行管均为阳性，0.25λ平行管均为阴性，且阴性对照为阴性时，实验方有效。2.4待测细菌内毒素工作标准品内毒素溶液的制备取细菌内毒素工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕,75％酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。按照标示效价（Pe），用VmlBET水溶解，将细菌内毒素工作标准品稀释制备成所需浓度的细菌内毒素标准溶液即0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.0625EU/ml（λ1为0.25EU/ml标示灵敏度）和细菌内毒素工作标准品标准溶液即0.0625EU/ml、0.03125EU/ml、0.15625EU/ml、0.078125EU/ml（λ2为0.03EU/ml标示灵敏度）。当使用细菌内毒素工作标准品（内毒素含量为10EU/支,按照鲎试剂为0.25EU/ml）时的方法如下：复溶：准确吸取BET水lml加入细菌内毒素工作标准品的安瓿内，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器混合15分钟，即为10EU/ml内毒素标准溶液。稀释：取0.3ml内毒素标准溶液加上2.7mlBET水，得到1EU/ml内毒素标准溶液。取1EU/ml内毒素标准溶液1.0m1稀释液，加上1.0mlBET水，得到0.5EU/ml内毒素标准溶液。往后依次类推。也可写成下列格式：

0.3ml

1ml

1ml

1ml

10EU/ml——→1EU/ml——→0.5EU/ml——→0.25EU/ml——→0.125EU/ml

2.7ml

1ml

1ml

1ml1ml

1ml

1ml

1ml—→0.0625EU/ml——→0.0312EU/ml——→0.0156EU/ml——→0.0078EU/ml1ml

1ml

1ml

1ml在上述稀释过程中，每稀释一步，均须在旋涡混合器上混合30秒钟。即工作标准品的稀释倍数为：Pe/V/2λ1=20倍，Pe/V/λ1=40倍，Pe/V/0.5λ1=80倍，Pe/V/0.25λ1=160倍。当使用细菌内毒素工作标准品（内毒素含量为10EU/支，鲎试剂为0.03EU/ml）时即将细菌内毒素工作标准品稀释：Pe/V/2λ2=160倍，Pe/V/λ2=320倍，Pe/V/0.5λ2=640倍，Pe/V/0.25λ2=1280倍。2.5鲎试剂的准备在制备内毒素标准溶液的同时，取0.1ml/支的鲎试剂34支轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底。用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75％乙醇棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内，每瓶加入0.1mlBET水复溶，使内容物充分溶解，避免产生气泡。3试验方法及结论3.1加样3.1.1将灵敏度为0.25EU/ml的充分溶解的鲎试剂34支（管）放在试管架上，排成9列，其中4支(管)4列分别加入0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.015625EU/ml、0.0078125EU/ml的细菌内毒素国家标准品溶液；4支(管)4列分别加入稀释了20倍、40倍、80倍、160倍的待测工作标准品。2支（管）1列分别加入BET水。内毒素标准溶液和BET水的加样量均为0.1ml/支。将灵敏度为0.03EU/ml的充分溶解的鲎试剂34支（管）放在试管架上，排成9列，其中4支(管)4列分别加入0.0625EU/ml、0.03125EU/ml、0.015625EU/ml、0.0078125EU/ml的细菌内毒素国家标准品溶液；4支(管)4列分别加入稀释了160倍、320倍、640倍、1280倍的待测工作标准品。2支（管）1列分别加入BET水。内毒素标准溶液和BET水的加样量均为0.1ml/支。3.1.2加样结束后，轻轻混匀，避免产生气泡，放入37℃±1℃内毒素凝胶法测定仪中，保持水平状态，保温60分钟±2分钟，观察结果。4试验结果4.1细菌内毒素国家标准品9000EU/支，待测工作标准品的效价为10EU/支，标示灵敏度为0.25EU/ml时，检测结果如下表1和表2：表1细菌内毒素国家标准品反应终点浓度国家标准品浓度（EU/ml）0.50.250.1250.0625阴性对照反应终点浓度重复管数1＋＋---0.252＋＋--0.253＋＋---0.254＋＋--0.25表2细菌内毒素工作标准品反应终点浓度工作标准品稀释倍数204080160反应终点稀释倍数重复管数1＋＋--402＋＋--403＋＋--404＋＋--40反应结果为：工作标准品效价Pt的计算Pt=antilog(∑X/4)×antilog(∑D/4)×V（EU/支），其中X为国家标准品系列反应终点浓度的对数值，D为工作标准品系列反应终点稀释倍数的对数值。Pt＝antilog[(lg0.125+lg0.25+lg0.25+lg0.25)/4]×antilog[(lg40+lg40+lg40+lg40)/4]×1＝10EU/支国家标准品浓度（EU/ml）0.06250.031250.156250.078125阴性对照反应终点浓度重复管数1＋＋---0.031252＋＋--0.031253＋＋---0.031254＋＋--0.031254.2细菌内毒素国家标准品9000EU/支，待测工作标准品的效价为10EU/支，标示灵敏度为0.03EU/ml时检测结果表3和表4：工作标准品稀释倍数1603206401280反应终点稀释倍数重复管数1＋＋--3202＋＋--3203＋＋--3204＋＋--320表3细菌内毒素国家标准品反应终点浓度表4细菌内毒素工作标准品反应终点浓度反应结果为：工作标准品效价Pt的计算Pt=antilog(∑X/4)×antilog(∑D/4)×V（EU/支），其中X为国家标准品系列反应终点浓度的对数值，D为工作标准品系列反应终点稀释倍数的对数值。Pt＝antilog[(lg0.03125+lg0.03125+lg0.03125+lg0.03125)/4]×antilog[(lg320+lg320+lg320+lg320)/4]×1＝10EU/支4.结果判断：保温60分钟±2分钟后，观察并记录结果。将鲎试剂安瓿从内毒素凝胶法测定仪中轻轻取出，避免振动，将每支拿出缓缓倒转180°观察，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）。若阴性对照溶液平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液平行管均为阳性，阳性对照溶液平行管均为阳性，试验有效。细菌内毒素工作标准品效价为10EU/支，Pt在0.5Pe～2Pe（包括0.5Pe和2Pe）范围内，以0.25EU/ml和0.03EU/ml为鲎试剂的灵敏度。符核检验标准0.5Pe≤Pt≤2Pe。5.小结通过以上的实验可知用两个不同灵敏度的鲎试剂，用效价为9000EU/支细菌内毒素国家标准品（CSE）标定标示效价为10EU/支的细菌内毒素工作标准品（WSE），检测效价Pt在0.5Pe～2Pe（包括0.5Pe和2Pe）范围内，以0.25EU/ml和0.03EU/ml为鲎试剂的灵敏度。符核检验标准0.5Pe≤Pt≤2Pe。证明凝胶检测法的可靠性，规范了标化细菌内毒素工作标准品