奶粉中蛋白质含量实验方法

【摘要】目的尝试建立一种快速准确地测定奶粉中蛋白质含量的方法。方法使用三氯乙酸沉淀蛋白质后，运用BCA（二喹啉甲酸）法，在570nm波长处，分别测定标准蛋白质应用液与样品稀释液的吸光度值，基于测定液中蛋白质含量与其吸光度值呈正比关系，计算出样品中蛋白质的含量。结果待测溶液中蛋白质浓度在0～250μg/ml范围内标准曲线呈线性关系，其回归方程为：2，相关系数r=0.998，平均回收率为100.2%。结论结合三氯乙酸沉淀的BCA法适用于奶粉中蛋白质的快速检验和掺伪检验。【关键词】奶粉；蛋白质；BCA法；三氯乙酸；三聚氰胺ArapidandsimplemethodofproteindeterminationinpowderedmilkZhangZhiqiao,ShenGuodong,WangGang

FirstMiddleSchoolofHefei,AnhuiProvincialHospitalAffiliatedtoAnhuiMedicalUniversity,Hefei230001［Abstract］Objective

Toexplorearapidandsimplemethodofproteindeterminationinpowderedmilkwithoutothernitrogen-containingcompounddisturbanceinKjeldahldetermination.Methods

Conjugatedwithproteinprecipitationwithtrichloroaceticacid,BCA(bicinchoninicacid)methodwasused.Accordingtothepositiverelationshipofproteincontentwiththe570nmabsorbance,proteincontentwascalculatedinpowderedmilk.Results

Proteincontentinmilksolutionshowedagoodlinearrelationshipatthedetectionrangesof0-250μg/ml,withregressionequation:Y=301.12X-73.42andrelatedcoefficient:0.998,andtheaveragerecoveryratewas100.2%.Conclusion

BCAmethodconjugatedwithtrichloroaceticacidisadaptabletotherapidandsensitivedeterminationofproteininpowderedmilk.［Keywords］Powderedmilk;Protein;BCAmethod;Trichloroaceticacid;Melamine蛋白质是人类最重要的营养物质之一。因此，蛋白质含量一直是食品检测中的重要指标。目前蛋白质定量方法较多,如凯氏定氮法、紫外分光光度法和Lowry法等。虽然凯氏定氮法目前是测定蛋白质含量的国家标准方法，但其操作繁琐费时，且蛋白质含量是通过测定氮的含量推算得来的，容易被其他含氮物质干扰（如2023年9月“问题奶粉”的出现源于有人利用凯氏定氮法的缺陷，向牛奶中添加三聚氰胺造成蛋白质含量虚高）；Lowry法和紫外分光光度法存在显色所需时间长，灵敏度低，稳定性差等缺点［1］。为弥补这些不足，本实验利用BCA（二喹啉甲酸）法结合三氯乙酸沉淀法建立一种快速简便的测定奶粉中蛋白质含量的方法。

1

材料与方法孔历疮1.1

外延仪器与试剂抓获洗糠姻攻仪器底酶标仪栽（型秩号凤ELX80有0魂，可BIO-借TEKI清NSTRU寒MENT找S概公司）讨，静9无6手孔微孔板，叛化学分析滤女纸（直径刮：柏9c单m蒙，最大孔径移：娱10饲厦μ赤m纹，杭州新华怜纸业有壶限公司融），玻璃漏搏斗、烧杯等爱。按纷街欲疗闻试涨剂驼漏光明全庸脂速溶奶粉凶（黑龙江省扶光明松鹤乳跌品有限责痒任公司，产劳地：齐齐哈要尔，生产日裙期博：吃20231裁01君0茶），蒙牛学重生多维高钙肿高锌奶粉（号内蒙古伊利术实业夫集团股份有腰限公司，产团地：呼和浩键特，生产日痰期顶：悉20231引20宾7夫），尿素（辣分析纯，上份海苏懿化学信试剂有限公俘司），三聚叙氰胺（化学店纯，上海凌盛峰化学试剂犬）击，硝酸铵（威分析纯，汕崇头市西陇化抢工厂有限公蛙司），三氯旋乙酸（分析疏纯，国药集喝团化学试剂潮）砍，团BS允A枣（牛血清清浴蛋白，美贩国步Sigm喊a湾公司在）离BC绵A出试剂剧盒狮（飘PIERC友E防勒公起司矛，医BCA23挑22怨5溉），去离子片水。买盖诉1.2

其族实验方法躺嫌料着禾放方法原押理您复据资料谦介绍味，苹BC絮A扒法是目前已薄知的一种敏控感准确的蛋墓白质测试法召，广泛用于臣国内外企业智和科研院所所进行蛋白质晋含量检烘测。其主要询原理是：要攀分析的蛋白抵质在碱性溶葵液里德与超Cu2+吼踢反应产叠生推Cu+市鱼，是Cu啊+封与雾BC魂A爽形成一种紫舅色化合物，异其吸收峰明在么562n俗m纲波长处竖。斩BC闭A丰法定量分析情蛋白质具有委准确灵敏块（羡2尝0迷～吨2000愁千μ骡g/m柴l唐）、快速（萝约羽40mi垂n道）、稳定和休经济实用（津可以用试管拐或微孔板测雾定），以及置它是反应物禁与蛋白质皇直止接运作用，对铵文盐类等争含氮化袍合物的抗干嗓扰能力较强苹等特点。欲绘三氯乙泡酸沉淀蛋白翠质的主要原伏理：三氯乙饮酸作为蛋白饼质变性剂可何使蛋白质构鼻象辉发生改变，显暴露出较多拣的疏水基团馆，使之聚集虏沉淀。据文毫献报道，三匆氯乙酸比硫吵酸铜等物质洞能继更好地排除往非蛋白氮对资溶液中蛋白异氮的影响，静具有广泛的础适用性。脱叮忆剖挤轨标准应用曲斥线的绘慈制窑匪配离制喜2mg/波m赏l诉牛血清清蛋举白能（侄BS旧A维）溶液作为言标准蛋白质干储存液（含推有兵9g/L狸夺氯化钠），晨参扛照宵BC申A筑试剂盒说明畜书所示方法申，按质表撤1抹所示配制不肢同浓饰度款BS马A撞工作液，用碌定性滤纸过丑滤，收集滤迫液并记录龟体暖积帅，取其资中弹2甲00亦断μ手l勾滤液加入等域体积喂的抹10孔%趋三氯乙酸溶跨液，充分反镜应裂后迷1200饱0r/m慧i嘉n旅离缸心经30mi为n倍，吸取上清鼓液待测；孕以圣9g/L答踪氯化钠溶液幅为空白对照于，吸取上述抹滤液及其三放氯乙酸沉淀丸后的上清液堵各璃25忙冒μ隆l娇加入悉微孔板上相碎应的各个微爸孔中，每孔佳还加山入足200罩夸μ绵l然A蒙液欣与速B删液仙（拍10A祥∶含1涉B俭）的混合工烈作液葬，说60关℃职水扑浴尸30mi敢n辽，用酶标仪险在虏570n针m拥波长下测定俭各个微孔中榨溶液的吸光莲度，以吸光逮度为纵坐标偏，蛋白质质遥量浓度为横逃坐标，计算秘标准回归方累程并绘制工原作曲线。叙表瞧1

著乳不同浓怕度提BS紫A厘工作液的配觉方（略）燕陆搏1.露2弱.3

凭尼样品踢制备与窗测悔定枝勇准确称逆量牛奶竹粉熊150m抚g耗/投份垄和茶300m辛g乱/喷份月各兄4烫份，分别倒且入贴活有赞1固、罚2主、胆3齐、盯4骡、脑5孔、天6璃、羊7僻、低8激标签要的努8谊个肿50m氧l枯离心管中，竟再分别称哈量锤2纷0m么g跳的硝酸铵、寒三聚氰胺和闸尿素倘各主2疫份，按裁表敢2住示倒入对应甚的离心管中牧。加入适榆量阴60宫℃险9g/被L局堂氯化钠溶液苍充分溶解，绵并证用压100m高l某容量瓶定容晨至刻度。用隆定性滤纸过党滤，收集滤忍液并记录体麻积，取其健中竭200战侍μ迫l椒滤液加入等贷体积君的呼10欲%成三氯乙酸溶趣液，充分反兵应变后倾1200碧0r/m久i姓n藏离榴心宅30mi典n诚，吸取上清肯液待测；排以昏9g/L害松氯化钠溶液戚为空白对凝照装，悟吸取上述滤悠液及其之三氯乙浸酸沉淀后的功上清液亩各暖25拿首μ点l搞加入微孔板宽上相应的各寺个微孔中，耽每孔还加垫入掀200悲融μ吃lA推B桃（秀10A木∶婆1况B工）混合液液，围60下℃纷水摩浴舌30mi丰n粥，用酶标仪第在狗570n谱m州波长下测定础各个微孔中心溶液的吸光营度，从亡标准工作曲时线上查出对谱应的蛋白质熔浓度。座表询2

匆魄待测样品组变成（略）堤绕归特配辉分析结果的于表述与计轻算嫌挥样品中俯蛋白质的含源量应X美按耽式点(1慧)关计算昂：刃X=10C访·F(1横)涛，式中叨：干X详-重样品中蛋白幅质的含量统，馅g/100排ml(g口)江，泽C坊-亡测定样品溶鸡液中蛋白质轧含量蚂（欣mg/m嚼l葵）帽，湿F浆-数稀释倍数。杯饼隙1.2碌.馅5

污护允许泰差烦诵意转同一样品的击两次测定结饮果之差，不凶得超过平均勤值司的攀51冷%复。马磨哥2

摸问结果杨肺沃2.1

厌桶标绍准工作曲线愉及线性范臣围初在触以岛BS繁A匠各级工作液太的蛋白质浓盈度够（胆Y愉，槐μ堪gmoL-忧1浊）对杏其捧O忽D窗值棍（呈X傅）作图，结汤果表明倦蛋白质浓度黎在架0码～六250挠隔μ顿g/m偷l句范围内标准持工作曲线呈赠线性关系，巡标准曲线方些程敲：饼Y=301糊.12X-异73.4梳2英，相关系脆数蛾r=0.9鬼9名8诞。见附图。吸附搬图计柏争蛋白质含量爪测定的标准乔曲积线述2.2

呆巡样品测定中盾干扰因素的半影志响财予达取上述添加敏了不同干扰贩物质的样品慢，按上述实累验方法进行描操作，结果禾发现，鹿在编60也℃阔的水中郊三驾聚送氰感胺等添加全物质都队能充分拼溶解，只是言过滤速度表梦现不一样：叠添加了三聚凑氰胺的奶粉毒溶液过滤速歪度最快爬（教3舅号挎和课7败号管分别用鞠时扎为丛19mi骑n竹和渠21mi冤n李），添加了碍尿素的奶粉承溶液次之屋（僻4安号积和剑8洽号管分别用译时报为授79mi盟n碌和失92mi困n顷），添加了释硝酸铵的奶宏粉溶液最慢歪（日2各号捡和穴6疾号管分别用袭时仁为胳112m林i膏n脸和惨124m昼i仆n鼻）。派养分别收仇集滤液和三猛氯乙酸沉淀专后的上清液漠进便行院BC伯A蹦法检测蛋白归质含量，测垂得各项实验炉数据如透表固3不。结果发现卸三种不同的辟非蛋白质的评含氮化合物唯基本不影响份蛋白质含量闹的正确测定鞋：质原量梢150m扯g狱的奶粉添加工三种禾含绑氮扮化合物后平绸均蛋白盯质含量角为堂35.72钱m侧g纹，标准方差阶为敢1.38渐m柜g赞；质斗量苏300m享g针的奶粉添加贞三种含氮化板合物后平均王蛋白质含量沙为懂62.13奉m闲g她，标准方差辰为西1.43定m仍g坊；分别与空流白对照旱的微34.96辰m乏g纳和维65.56悄m屠g检，以及厂家仓奶粉中蛋白期质标示跨量铁36m翻g帖和疾72m甲g乞相比，二者族差异都不明春显。同时实舟验结果也表助明本实验所邀用奶粉的蛋晶白质含量达近到国家要求厉（我国《食大品营养标签裹管理规范》柿的技术附件际中规定，对隶于蛋白质和四碳水化合物布，其允许的凯误差范围旋是戚≥透80夸%歼标示值）。在表勒3

纯莫不同样品蛋魔白质含量测田定（略）东甩怜2.3

戒想方法的加标标回播收符率脊仙分别取斯奶哲粉梨1仍（光明全脂橡速溶奶粉，柱其稀释液为搅稀释天液酬1亿）和奶笑粉兰2拒（蒙牛学生巧多维高钙高真锌奶粉，其者稀释液为稀吊释扯液玻2傍）加削入炼60肢℃溉9g/叛L齐斗氯化钠溶液够进培行盏1/10戒0五0辞样品稀释，丝做方法加标生回收试验，锡结极果见陶表掠4陶，该方法的式平均加标回别收率巩为耳100.2波%胡。将表政4

私室方法的加标倾回收率搬匀碰3

古烂讨论侄咽录奶粉中蛋白细质含量是奶疑粉检验工作物的一项重要铁指标。目前匹国内主要采雨用常规凯氏旷定氮法挣，艰地国外也多采零用常规或改夕良的凯氏定闸氮法测定食窜品中蛋白质貌含量，但此草法费时、费拼水、费电，永操作繁琐雅，捆论试剂消耗量轮大，且不能祥有宽效情区灯分非蛋白氮窑［饭2喘、哀3虽］。常见的护含氮化合物哑如硝酸铵和盯尿素比牛奶肚蛋白质的含含氮率都高，仆易溶于水，旨很容易掺入跨奶粉等食物球中；而三聚火氰胺虽然常牵温和冷水状句况下在水中妻的溶解度非垂常低没［所4密］，但是人稀们平时习惯执上和奶粉说响明书上都要芹求用温开毙水冲调，例题如请60雀℃如时三聚氰胺泻在棒100群g开水中可以溶即解截1.8类g尝，丽100尿℃辜时溶轿解粘6.4都g膜，因而掺伪松问题容易受肿到人们的忽逆视。司显轧国内已有多恶篇文献涉及云有关乳制品鞭中蛋白质含限量测定方法缝的研究，例劝如，云南工虎业大学张惠精芬等探讨了晚在奶粉、豆裙奶粉、鱼粉馒中人为掺入已尿素、硫酸倘铵等含氮化粉合物对蛋白念质测定的影亚响钞，匪结介果表明：里用泉95俊%迅乙醇能很好躬地将尿素与牙食品中蛋白嘴进行分离，像回收率较高哀，并能方便除、快速测定泄掺入量。对垫掺入硫酸铵酷等无机铵盐削的测定，采构用予加启Mg旅O驻调到弱碱性平，直接蒸馏武测定责［蔑5晶］。成都理滨工大学李海此玲等通过吗对狼Lowr坚y辜法映、哈BCA善法、磺基水历杨酸沉淀法慧、怖Bradf竞or担d高法蓄等懒4依种常用蛋白祥浓度测定方肆法的研究认俊为，确淘定左PEG-I血L-吧6舅的最佳蛋白向浓度测定方蚊法慰为底BC石A宇法，而包涵慕体变性液中曲的蛋白浓度急只能体用腹Bradf踩or近d关法测定炉［静6许］。中国农燥业大学食品席科学与营养栗工程学院牛撞巍等利用三栏氯乙酸沉淀呀蛋白法和硫炕酸铜沉淀蛋削白法对添加肥了非蛋白氮律的液尊态嫩奶宗进行蛋白氮刻测定。仁结果表配明，三氯乙叙酸沉淀法能膝更有效地排嗓除非蛋白氮备对液态奶蛋丰白氮测定的习影响获［工7唇］。河北省董衡水市疾病锣预防控制中身心田志梅等故分别运用紫替外分光光度朵法及甲醛值排滴定法快速垫测定液体奶价、奶粉中蛋是白质含量。约结果显示，富两种饰方法均可有臣效解决非蛋咽白质类含氮帖物质对牛奶房中蛋白质测仔定结果的干揭扰问题榜［竟8,宏9毕］。中国农迁业大学侯彩沸云等使用三车氯乙酸使蛋国白质沉淀后叹，不同含量果的蛋白氮在贤碱性条件下研与双缩脲试窜剂形成深浅参不同的蓝紫画色的络合物翅，根据其色脚度值与蛋白搭氮含量高低像呈线性相关品关系，用计卵算机软件自婆动分析获得球的样品色度距值，从而计恨算出蛋白氮导含三量洋［拍1膛0婆］。证寺约泳综上所述，米目前国内用竭于测定奶粉喜中蛋白质含降量的方法有颗多种，其测伞定原理及结狸果的准确性啊各不相同，巧每种方法都装有其优点及血局限性。相债比较而言，聋本项目运哨用蹈BC药A偿法结合三氯学乙酸沉淀蛋璃白法检测奶哀粉中蛋白质趣的含量，逃可以有效排肝除三聚氰胺丙等非蛋白氮怕的干扰，具穷有简便、快距速、准确、度实用的特点母，可作为检悟测机构和平虎时人们准确身检测蛋白质嗽含量时考虑北运用的方法受之一。奶营养成分很高，富含蛋白质和微量元素钙、铁、锌等，是人们生活中的主要要营养食品之一。因此，分析牛奶中的营养成分含量是很有必要的工作。本实验在普通实验室条件，采用简单科学快捷的方法分析某品牌牛奶中部分成分含量。摘要：牛奶营养成分很高，富含蛋白质和微量元素钙、铁、锌等，是人们生活中的主要要营养食品之一。因此，分析牛奶中的营养成分含量是很有必要的工作。本实验在普通实验室条件，采用简单科学快捷的方法分析某品牌牛奶中部分成分含量。关键字：牛奶蛋白质钙铁锌1、实验目的用分光光度法测某牛奶中蛋白质、钙、铁、锌的含量。2、实验原理牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。钙与身体健康息息相关，钙除成骨以支撑身体外，还参与人体的代谢活动，它是细胞的主要阳离子，还是人体最活跃的元素之一，缺钙可导致儿童佝偻病，青少年发育迟缓，孕妇高血压，老年人的骨质疏松症。缺钙还可引起神经病，糖尿病，外伤流血不止等多种过敏性疾病。补钙越来越被人们所重视。牛奶中含有易被人体吸收得钙，有些牛奶产品中还特地加钙而成为钙奶。对于液体牛奶中钙的含量，可采用EDTA法进行直接测定。考虑到牛奶中含有Fe3+、Al3+等干扰离子，可以加入少量三乙醇胺以消除它们的，调节pH≈12～13，以铬蓝黑R作指示剂，指示剂与钙生成红色的络合物，当用EDTA滴定至计量点时，游离出指示剂，溶液呈现蓝色。当一束光通过一个吸光物质（通常为溶液）时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。吸光度用A表示。A＝abc，其中a为吸光系数，单位L/(g·cm),b为液层厚度（通常为比色皿的厚度），单位cm，c为溶液浓度，单位g/L影响吸光度的因数是b和c。a是与溶质有关的一个常量。此外，温度通过影响c，而影响A。符号A，表示物质对光的吸收程度。邻二氮菲也叫邻菲啰啉，是测定微量Fe2+的高灵敏度显色剂在pH2～9的条件下，Fe2+与邻二氮菲生成稳定的橙红色络合物，在510nm波长处有最大吸收。测定时，控制溶液的酸度在pH＝5左右较为适宜。酸度高时，反应进行较慢；酸度太低，则Fe2+离子水解，影响显色。当铁浓度在5.0mg／mL以内时，吸光度与Fe2+浓度呈直线关系。Bi3+、Cd3+、Hg9+、Ag+、Zn2+等离子在pH＝2~9时与邻二氮菲生成沉淀。Co2+，Ni2+，Cu2+等离子可与邻二氮菲形成有色配合物，故应注意它们的干扰。锌是人体中必需的微量元素之一，锌缺乏会阻碍生长发育，过量又会导致胃癌等疾病。人类从牛奶等饮食中可以获得一定量的锌。在pH4.0～5.5的水溶液中，锌离子与双硫腙（C13H12N4S）生成红色螯合物，摩尔吸光系数535=9.3×104L·mol-1·cm-1用四氯化碳萃取后比色定量。在选定的pH条件下，用足够量的硫代硫酸钠可掩蔽水中存在的少量铅、铜、镉、钴、铋、镍、金、钯、银、亚锡等干扰金属离子。3、实验步骤3.1、试剂的配制3.11、pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液的配制:先配A液与B液。A液：0.2mol/L醋酸钠溶液。B液：0.2mol/L醋酸溶液。取醋酸钠固体6.5461g加水溶解并稀释至100ml，取冰醋酸5mL加水稀释至100ml，混合即得pH4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液200mL。3.12、乙醇—乙醚混合液的配制：取25ml95％乙醇与25ml无水乙醚混合3.13、双缩脲试剂：称取CuS04·5H2O0.3g，酒石酸钾0.9g和碘化钾0.5g，分别溶解后混匀，加6mol·L-1NaOH10mL，最后加水至100mL，贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。3.14、蛋白质标准液(10mg·mL-1)，用小烧杯称取干燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理盐水溶解后倒入l0mL容量瓶中，淋洗小烧杯数次，一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线。待测蛋白样本：将牛奶样品用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定；将制得的酪蛋白用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定。（如若不能溶解，滴加几滴6mol/LNaOH溶液、分别用l0mL容量瓶定容）3.15、铁标准溶液(40.0µg·mL-1)：:准确称取0.0345g硫酸铁铵〔NH4Fe(SO4)2·12H2O〕于烧杯加入6mL6mol·L-1HCl和少量水，溶解后用纯水定容至10mL。此溶液1.00mL含有40.0µg铁。3.16、盐酸羟胺溶液(100g·L-1)：:称取10g盐酸羟胺(NH2OH·HCl)，溶于水，并稀释至100m（新鲜配制，两周内有效）3.17、邻二氮菲溶液(2g·L-1):：称取0.20g邻二氮菲(C12H8N2·H2O)，溶解于加有2滴浓盐酸的纯水，并稀释至100mL（新鲜配制，两周内有效）3.18、醋酸钠溶液（1.0mol·L-1）：:称取8.2030g殖醋酸钠，用母纯水溶解后及稀释至撇100mL抗。刮3.19斑、锌标准溶沉液（夹1.00巡µg煎·化mL勺-1貌）：哭准确称取秀0.010医0g党基准锌于碗100mL霉烧杯中，加速入挣6mol非·L蚁-1糊HCl0进.5mL颜，立即盖上旬表面皿，待愚锌完全溶解国后，以少量奖水冲洗表面营皿及烧杯壁裳，将溶液转此入慎100mL肝容量瓶辣中，定容，纷即为锌标准颗贮备溶液。什准确移取皂1mL冒锌标准贮备膊溶液，稀释柏定容至福100.0死mL号，即得搁1.00寄µg薄·旧mL研-1轻锌标准溶液餐。掉3.20菊、股0.1撕％双硫酸腙抖四氯化碳贮尘备溶液：称泻取尤0.10g绸双硫腙（扔C诸18喂H交12他N虚4味S芳），在武干燥的烧杯予中用四氯化枝碳溶解后稀僚释至肠100m轨L族，屈宅倒入棕色瓶叔中。此溶液依置冰箱内保戏存，可稳定座数周。屈3.21产、双硫腙四竿氯化碳溶液主：临用前，极吸取适量双峰硫腙四氯化般碳贮备溶液仰，用四氯化航碳稀释约懒30侨倍，至吸光论度为混0.4扔（波长异535n抬m坡，终1cm帆比色皿）。题3.22铅、鬼25竞％硫代硫酸箭钠溶液：称平取模6译4.6亡0g必硫代硫酸钠嫂（扬Na棉2抗S胞2灰0蓄3再·5H食2叛0)魂，溶于驳100mL慌纯水中。牌3.23晨、诊1士＋池1玻氨水溶液惊:10ml浇氨水加牛10ml畏水稀释伤3.2居、牛奶中酪虫蛋白的提取骄3.21片、酪蛋白的航粗提钻

5婚0mL栋鲜牛奶加热旗至于40挡℃接。在搅拌下弱慢慢加入预寻热至豪40须℃播、蒸pH4.7贩的醋酸缓冲静液纵50mL.质用精密谎pH书试纸或酸度推计调速pH捷至娘4.7祸。聪将上述悬浮议液冷却至室宋温。离心税15相分钟（学3000城r·mi凉n锈-1鞭）。弃去清睛液，得酪蛋经白粗制品。华3.22据、酪蛋白的套纯化嗓用水洗涤沉朋淀签3掀次，离心禁10论分钟（袭3000r资·min择-1没）倒，弃去慌上清液。在样沉淀中加入戏30mL登乙醇，搅拌倚片刻，将全思部悬浊液转访移至布氏漏倘斗中抽滤。息用乙醇逐—顶乙醚混合液龙洗沉淀柔2遣次。最后用暑乙醚洗沉淀桶2益次，抽干。侵将沉淀摊开菠在表面皿上阳，风干；得膊酪蛋白纯品抄。刺3.身3浊、酪蛋白含巡量的测定价3.31零、标准曲线侦的绘制与样埋品的测定虚积取试管毁8己支，按下表穷操作。束各管混匀、述放置南37秋℃珠水浴中保温狸20min白。滩540nm瘦比色劣，以空白管愿调零点，读白取各管吸光强度值。馅3.32素、计算犹在电脑上以卖吸光度值为蜜纵坐标，以名蛋白质浓度恋为横坐标绘再制标准曲线舒。从标准曲举线中查出待陆测样本的蛋辽白质浓度反(g猴／崖L)类，并迷求出牛耍奶中蛋白质攀浓度。由此烟浓度计算出斜100mL叛鲜牛奶中酪伴蛋白的真实酸含量。屡3.4衰钙含量的测供定统3.41欧、钙制剂钙仿含量的测定黑准确移取游25ml拔的鲜牛奶和巡钙奶，分别械转移到兄100mL处容量瓶中，严用水稀释至归刻度，摇匀错。扇卫准确绪移取上述试蚊液侧20.00丧mL好，加入三乙寸醇胺溶液流5mL串，匆5mol·撞L逮-1注NaOH凤4mL孟，加入水浙20mL委，摇匀，加捏铬蓝黑乡R忆8~10即滴，用吊0.01m桂ol·L师-1绢EDTA草标准溶液滴旷定，接近终阔点时再补加图2斯～徒3怖滴铬蓝黑，惧当溶液由红孔色变为蓝色期即为终点，横根据消耗蔽EDTA快的体积，计房算出鲜奶和流钙奶中钙的限含量想（种g/淘100mL趟），并与包饶装上注明的堤含量作比较草。阀带3.42暖、注意事项摸量取鲜奶和牲钙奶的量视胶钙含量多少鸽而确定，以紫消耗崇0.01奖mol·L诸-1敢EDTA摇体积为线20~30度mL兽。牛奶、由裤于钙奶均为廉乳白色，终岔点颜色变化刘不太明显，追接近终点时撤再补加立2呆～弦3狱滴指示剂。培云3.5漏铁含量的测启定悄3.51雨、标准曲线麦的绘制主取但25mL辞比色管亮6轻支，按下表劲顺马序配制铁标励准系列并记况录测量的数漠据（注意：已加入盐酸钱派干后需摇匀窝放置全2min奴，再进行下舅一步操作）终，加完试剂什后摇匀，放罢置摇37赞℃孩水浴中保温植15min林，以空白液狐为参比，在押510n跌m递下测箭定各溶液的本吸光度值。造取浊25mL奸比色管监2无支，按照上窃表及上述方沫法测定多510n锯m促下的吸光度扬值。竹3.52斗、计算猛帮在电脑上以衰吸光度值为渠纵坐标，以纵铁质量浓度析（霞µ勺g福·讲mL室）浓度为横链坐标绘制标圾准曲线。幅利用标准沈曲线计算鲜萄奶中铁的含非量（销mg/10吐0mL饱）。直3.53胳、样品的测荒定爷将校50ml界鲜奶一滴一甚滴加到热坩愚埚中