食管鳞癌tgf受体基因启动子区甲基化状态研究

食管鳞癌tgf受体基因启动子区甲基化状态研究第1页/共25页并非所有暴露个体均患病

环境因素与遗传因素共同作用食管癌遗传因素和表观遗传因素亚硝胺类化合物吸烟、饮酒营养缺乏霉菌感染冀医四院第2页/共25页传统的多途径多步骤的基因突变引起肿瘤的观点日益受到挑战，目前众多的研究者认为，肿瘤最早的发生可能源于干细胞阶段的表观遗传学改变，表观遗传学的改变可能发生的更早些。RNA干扰

表观遗传学DNA甲基化组蛋白修饰染色体重塑冀医四院第3页/共25页DNA甲基化是在DNA甲基转移酶的作用下,以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体,将甲基基团转移到胞嘧啶第5位碳原子上,从而转变成5-甲基胞嘧啶（5-mC）。基因启动子区域的CpG岛正常状态下不发生甲基化，一旦由于某种原因而发生甲基化就会导致基因转录沉寂，使重要基因如抑癌基因、修复基因等丧失功能，有可能导致肿瘤发生。冀医四院第4页/共25页冀医四院第5页/共25页

头颈部鳞癌、胃癌及胰腺癌细胞株中TβRⅠ基因甲基化与其表达降低有关。

对非小细胞肺癌、前列腺癌的研究显示，TβRⅡ基因的表达缺失与其甲基化之间存在高度相关性。

小细胞肺癌中TβRⅠ和Ⅱ表达缺失与基因甲基化无关。冀医四院第6页/共25页研究目的

本研究应用甲基化特异性PCR反应(MSP)和RT-PCR技术检测食管鳞状细胞癌组织中TGF-β受体Ⅰ、Ⅱ基因(TβRⅠ、Ⅱ)启动子区甲基化状态和mRNA表达水平，并结合临床资料探讨其与临床病理资料的关系，为确定TβRⅠ、Ⅱ甲基化与ESCC发生发展之间的关系提供理论依据。冀医四院第7页/共25页65例贲门癌组织、59例相应癌旁组织性别：男性51例，女性14例TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期37例，Ⅲ、Ⅳ期28例病理分级：高、中分化组55例，低分化组10例年龄：范围在26-74岁，中位年龄57.4岁冀医四院第8页/共25页

基因CpG状态

引物序列（5’—3’）退火温度(℃)产物大小(bp)

TβRⅠ

UCAACCCTCCAAAACTAACAACTAAACAA60147TGTTGGTTTTTGGTTATGTTTTATGTTTTTT

MACCCTCCGAAACTAACGACTAAACGA52142CGGTTTTTGGTTACGTTTTACGTTTTT

TβRⅡ

UTTGAAAGTTGGTTAAAGTTTTTGGA55123AAACAAAACCTCTCTCCACCCA

MGAAAGTCGGTTAAAGTTTTCGGAACAAAACCTCTCTCCGCCCG53119冀医四院TβRⅠ和TβRⅡ基因MSP引物第9页/共25页

MethylationanalysisofTβRⅠandTβRⅡ

intumortissue(T)andcorrespondingnormaltissues(N).

u:indicatesthepresenceofunmethylatedgenes;m:indicatesthepresenceofmethylatedgenes.Cases1:tumor-specificmethylation;Case2:thetumorisfullymethylated,whereasthecorrespondingnormaltissuehasaveryfaintbanddemonstratingmethylation;Case3:bothoftumorandcorrespondingnormaltissueunmethylated.

case1case2case3冀医四院

TβRⅠ

TβRⅡ

case1case2case3第10页/共25页UnmethylatedMethylated原始序列：GGGGAGCGTGGGGCGTGGCCAGAAACCGG非甲基化序列：AAAAAACATAAAACATAACCAAAAACCAA甲基化序列：AAAAAACGTAAAACGTAACCAAAAACCGA冀医四院UnmethylatedTβRⅠMethylatedTβRⅡ原始序列：TCGGGCGGAGAGAGGTCCTGC非甲基化序列：TTGGGTGGAGAGAGGTTTTGT甲基化序列：TCGGGCGGAGAGAGGTTTTGT第11页/共25页FrequencyofTβRⅠ,ⅡgenemethylationinESCCandadjacentnon-canceroustissues

GeneMethylationratio

χ2Ptumortissueadjacentnon-canceroustissueTβRⅠ52.3%（34/65）40.7%(24/59)1.6800.195TβRⅡ70.8%(46/65)47.5%(28/59)6.9840.008冀医四院第12页/共25页

TherelationshipbetweenTβRⅠ,ⅡgenemethylationandclinicaldatainESCCGroupTβRⅠTβRⅡNMUχ2PMUχ2PESCC6534314619Age＜60371720289≥602817111.3930.23818101.0000.317GenderMale5126253516Female14860.1670.6831130.1540.694ClinicalstageⅠ+Ⅱ3721162710Ⅲ+Ⅳ2813150.6820.4091990.2020.653DifferentialdegreeWell-moderately5530254015Poorly10460.2530.615640.1900.663冀医四院第13页/共25页

FrequencyofTβRⅠ,ⅡgenemethylationincommoninESCCandadjacentnon-canceroustissue

Group

TβRⅠandⅡgeneSimultaneousmethylationNon-simultaneousmethylationχ2Ptumortissue31(47.7%)343.8210.051Non-canceroustissue18(30.5%)41冀医四院第14页/共25页TherelationshipbetweenTβRⅠ,ⅡgenemethylationincommonandclinicaldatesinESCCGroup

TβRⅠandⅡgeneSimultaneousmethylationNon-simultaneousmethylationχ2PDifferentialdegreeWell-moderately28270.7630.382Poorly37ClinicalstageⅠ+Ⅱ19180.4610.497Ⅲ+Ⅳ1216冀医四院第15页/共25页

目前认为DNA甲基化主要在转录水平抑制基因的表达，TGF-β受体Ⅰ、Ⅱ基因的甲基化对其mRNA的表达是否有影响呢？冀医四院第16页/共25页

基因

引物序列（5’－3’）退火温度

(℃)产物大小

(bp)TβRⅠGGAGAAGAAGTTGCTGTTAAG57419ATGGTATCTGTGGCTGAATCTβRⅡCAACATCAACCACAACACAGAG54248CCGTCTTCCGCTCCTCAGGAPDHGGGAAACTGTGGCGTGAT60342GTGGTCGTTGAGGGCAATTβRⅠ和TβRⅡ基因RT-PCR引物冀医四院第17页/共25页

RT-PCRanalysisofTβRⅠ

ma:100bpDNAmarker;1,3,5,6:positivemRNAexpression;2,4:negativemRNAexpression冀医四院

RT-PCRanalysisofTβRⅡ

ma:100bpDNAmarker;1,3,5,6:positivemRNAexpression;2,4:negativemRNAexpression第18页/共25页TheexpressionofTβRⅠ,ⅡmRNAinESCCtumorandadjacentnon-canceroustissuesGeneTumortissueadjacentnon-canceroustissuetPTβRⅠ0.77±0.170.99±0.31-3.3930.001TβRⅡ0.89±0.301.10±0.29-2.3580.022冀医四院第19页/共25页GeneESCCtPMethylatedUnmethylatedTβRⅠ0.74±0.180.81±0.15-1.2870.206TβRⅡ0.86±0.330.95±0.20-0.9220.362TherelationshipbetweenmethylationandmRNAexpressionofTβRⅠandⅡ冀医四院第20页/共25页

本研究结果显示食管鳞癌组织中TβRⅡ的甲基化率高于癌旁组织，其mRNA的表达量也明显低于癌旁组织，但是发生甲基化的癌组织与未发生甲基化的癌组织相比，其mRNA表达虽然降低，但却无统计学差异。

冀医四院第21页/共25页部分肿瘤组织可能由于基因启动子区甲基化程度不足以抑制转录而导致了发生甲基化的组织其mRNA表达仍可为阳性。1除了甲基化外，可能还有其他使该基因表达下