酶处理对初榨橄榄油品质与抗氧化活性影响

酶处理对初榨橄榄油品质及抗氧化活性的影响（南京林业大学轻工与食品学院食品科学与工程系1，南京210037）（重庆第二师范学院生物与化学工程学院2，重庆400067）摘要：本研究将纤维素酶、果胶酶应用于橄榄油提取工艺，旨在生产具有较高总酚含量及较强抗氧化活性的高InfluenceofEnzymesonQualityandAntioxidantActivityofVirgOliveOilHUANGShuai1JIANGRui1初榨橄榄油（VirginOliveOil,VOO）是由初熟或成熟的油橄榄鲜果在采后24h通过物理压榨工艺提取的木本植物油，因其独特的营养价值受到消费者的青睐[1]。橄榄油含有丰富的不饱和脂肪酸、多酚、类胡萝卜素等生物活性物质，且油酸、亚油酸和亚麻酸的比例符合人体需要，在西方国家被誉为“液体黄金”[2]。橄榄油的品质随着化学组成的变化而改变，并且会受橄榄基因型以及农艺、环境和技术等因素的影响[3,4]。提取工艺是影响橄榄油化学组成的主要因素之一，提取方式、温度、融合时间等因素都会影响油的化学成分[5]。橄榄果破碎后，果实中的内源酶会激活并逐渐释放，在融合的过程中，一些新的化合物会通过化学或者内源酶的途径产生[6]。许多因素，如融合过程的温度、橄榄糊暴露在空气中的时间、微生物或酶等都会显著影响橄榄油提取效果及橄榄油的品质[5,7]。近年来，将创新提取技术应用于橄榄油的萃取中从而提高橄榄油的品质或产量已成为国内外研究的热点，这类技术主要包括在橄榄油提取过程中使用微波、超声波、热交换技术[8-10]或者在橄榄果糊搅拌融合的过程中加入滑石粉或者酶制剂来提高橄榄油的产量和质量[11,12]。酶解法由于其高特异性和低操作温度，在橄榄油提取工业中具有较高的应用价值。在橄榄融合的过程中，酶制剂的加入可以破坏植物的细胞结构，并从细胞中释放出油脂和水。植物细胞壁主要由果胶物质、纤维素、半纤维素和木质素构成。酶能减少亲水酚与多糖的络合，增加橄榄糊中游离酚的浓度，并在加工过程中释放到油和废水中。然而，由于酚类物质的亲水性，大量的酚类物质可能会溶解在废水中，因此，总酚的变化可能与橄榄的品种有关[12]。此外，酶制剂对含有油滴的橄榄糊状胶体系统也有类似的作用（如果胶、纤维素、蛋白质等）。因此，在橄榄糊融合的过程中加入酶制剂有助于提高出油率并且提升橄榄油的品质。目前已有研究证明在橄榄融合过程中加入酶制剂可以显著提高橄榄油的出油率[13,14]，然而关于添加酶制剂对橄榄油脂肪酸组成、总酚及抗氧化活性影响的研究较为少见。另一方面，在橄榄提取过程中酶制剂的添加量对橄榄油品质的影响是巨大的，确定合适的酶添加量是获得高品质橄榄油的关键。因此，本研究选用重庆地区产量较稳定的豆果品种，在橄榄融合过程中加入不同剂量的酶，研究酶处理前后橄榄油质量指标、化学组分以及抗氧化活性的变化，结合相关性分析和主成分分析，确定最优的酶种类和添加量，以期为国内橄榄油的加工提供指导和帮助。油橄榄鲜果采集于重庆市合川区油橄榄种植基地，选取产量较稳定的豆果品种在油橄榄成熟初期（果皮全绿）进行手工采摘。采后24h内提取橄榄油。碎机将橄榄粉碎获得精细的糊状物3）将橄榄糊放入水浴中调节温度至37℃,并按0%、0.2%、糊45min5）6000r/min下离心20min获得橄榄油。（6）静置沉淀以获得清澈的橄榄油。收集到的橄榄油在4℃下避光保存。1.6酚类化合物的提取振摇1min后4000r/min离心15min，收集上层液体，重复提取三次后在40℃下浓缩并用80%甲醇油中没食子酸的含量表示（mgGAE/kg）。1.8总抗氧化活性的测定•+储备溶液用乙醇稀释至734nm处吸光度为0.70±0.02。物质的量表示(μmolTE/kg）。含有Trolox物质的量表示(μmolTE/kg）。10:1:1的比例混合而成。随后将20μL酚类提取液与180μLFRAP试于593nm处测定吸光度。结果以每千克油中含有Trolox物质的量表示(μmolTE/kg）。所有结果均以平均值±标准偏差（SD）表示，显著性分析采用单因素方差分析（ANOVA）,并进行Turkey检验比较平均值，根据油的质量指标、脂肪酸组成、总酚及总抗氧化活性，应用主成分分对橄榄油品质的影响以及各指标间的相关性。所有数据分析均采用SPSS19.0。)mm)mm%(aaabAb酶添加量C纤维素酶C3bab2d210酶添加量B纤维素酶Bbdcdc50酶添加量D纤维素酶D纤维素酶aa酶添加量橄榄油的游离酸度代表油脂中游离脂肪酸的含量，按油酸的百分比来计算，是评价橄榄油品质的重要指标之一，同时也是橄榄油分类的主要标准之一[16]。如图1A所示，所有橄榄油样品的游离酸度均在国际橄榄油理事会（InternationalOliveOilCouncil,IOOC,2003）确定的0.8的上限内。酶在破坏细胞壁的同时会释放出游离脂肪酸，加入果胶酶和纤维素酶后游离酸度出现明显的升高，此外，由于果胶酶对细胞壁的降解作用较大，在降解细胞壁的同时能释放出更多的游离脂肪酸，因此，纤维素酶处理后橄榄油的游离酸度总体低于果胶酶处理后的橄榄油。过氧化值和特定波长紫外吸收（K232和K270）主要用于评估橄榄油的氧化状态。是评估橄榄油品质的重要指标。过氧化值代表油脂规定的范围内（过氧化值：≤20mmol/kg；K232：≤2.50；K270：≤0.20）[16]。两种酶处理后，橄榄油的过氧化值都出现下降的趋势，当纤维素酶的添加量增加到0.8%时，橄榄油的过氧化值上升至11.75mmol/kg，显著低于未添加酶时获得橄榄油的过氧化值（p＜0.05）。加酶后K232也同样表现出下降的趋势，当两种酶的添加量增加到0.8%时，K232开始上升。此外，加入纤维素酶后K270未出现明显的变化。本研究的结果表明，在融合过程中添加果胶酶和纤维素酶能有效保护橄榄油不受氧化，显著降低油中初级氧化产物和次级氧化产物。2.2脂肪酸组成橄榄油的脂肪酸组成主要包括棕榈酸（C16：0油酸（C18：1）和亚油酸（C18：2以及少酸组成的变化，如表1所示，油酸是橄榄油中主要的脂肪酸，具有抗氧化和降血脂的作用，并且可以预防心血管疾病。酶在降解细胞壁时释放出大量的游离脂肪酸，因此，在融合过程中加入果胶酶和纤维素酶可以显著提高橄榄油中的油酸比例（p＜0.05在加入0.2%纤维素酶和果胶酶后，油酸橄榄油中主要的饱和脂肪酸，添加纤维素酶和果胶酶后，棕榈酸的含量显著降低（p＜0.05在纤也略有上升。亚油酸和亚麻酸是橄榄油中omega-6和omega-3族脂肪酸。经两种酶处理后，亚油酸比例没有明显的变化，而亚麻酸的比例随着酶添加量的增加显著提升（p＜0.05）。表1橄榄油样品的脂肪酸组成abaabcbabbabababbdcacba2.3总酚、总抗氧化活性及相关性分析橄榄油中的酚类物质是评估橄榄油品质的重要指标，酚类物质可以提高橄榄油的抗氧化性，并与橄榄油的苦味有关，橄榄油中酚类物质含量越高，苦味越强烈[19,20]。酶处理前后总酚含量的变化橄榄油的总酚含量也逐渐增加，并在添加量为0.5%时达到最高值（139.95mgGAE/kg由于果胶酶和纤维素酶能有效降解橄榄细胞壁，从而提高了酚类化合物的提取。此外，酶的存在能够降低橄榄糊中多糖与酚类之间的相互作用，这种相互作用会形成能够包埋多酚化合物的复合物，被认为是果糊破碎融合过程中酚类物质损失的主要原因之一。另一方面，这种机制诱导了乳液的形成，其稳定性取决于从橄榄和水中转移到橄榄油中的内源性两亲物（如磷脂、糖、蛋白质等）。乳液的稳定性对于橄榄油的质量（包括酚类化合物）至关重要[21]。酶处理前后橄榄油样品的抗氧化活性如图2（B、C和D）所示，ABTS和DPPH主要用于评估化合物的自由基清除活性，而FRAP主要用于确定样品的铁离子还原能力。添加0.2%和0.8%纤维素性达到616.85μmolTE/kg，显著高于其他样品（p＜0.05）。橄榄油的ABTS抗氧化活性在果胶酶添)TmTBA)TmTBA)TmARF加量为0.5%时最高，为515.14μmolTE/kg。当果胶酶的添加量增加至0.8%，ABTS抗氧化活性未出μmolTE/kg和479.60μmolTE/kg。当加入0.2%纤维素酶时，橄榄油的总酚和DPPH抗氧化活性都出现下降的趋势，这是由于当加酶量较低时，络合在纤维素等结橄榄糊中游离酚的浓度增加较少，并且由于酶释放出了细胞中的水分，使得大量的亲水酚溶于废水中，因此，加入少量酶会降低总酚及DPPH抗氧化活性[6]。FRAP的变化趋势与ABTS抗氧化活性相似，在两种酶添加量0.5%时，铁离子还原能力达到最大。事实上，当两种酶的添加量为0.5%时，橄榄油总酚含量与总抗氧化活性都达到最大，且总酚与K232呈显著正相关（p＜0.05）而与三种抗氧化活性之间呈高度的负相关，并与FRAP之间呈极显著负相关，相关系数r为-0.895。本研究的结果证明了果胶酶和纤维素酶能有效降低橄榄油中的氧化产物，并提高油脂的抗氧化能力。))AG))TmDaac0Abb酶添加量纤维素酶纤维素酶aacdCc0酶添加量B纤维素酶Baabbabb00酶添加量纤维素酶果胶酶纤维素酶果胶酶aabbbbbbbbb酶添加量图2添加不同量的纤维素酶、果胶酶对橄榄油总酚及总抗氧化活性的影响。a,b,c,d添加酶种类相同时，不同的字母表示差异显表2橄榄油质量指标、化学组成及抗氧化活性的相关性分析酸值过氧化值亚麻总酚ABTS0.5140.02CP-0.50.5140.02CP-0.5210-1酸值过氧化值-0.895**油酸%亚油酸%亚麻酸%总酚ABTS0.918**0.928**0.947****相关性显著（p＜0.01）*相关性显著（p＜0.05）主成分分析（PCA）是一种无监督的多元分析方法，通过降低原始数据矩阵的维数对数据进行分析。数据中提取的主成分可研究酶处理对橄榄油品质的影响，并确定哪些变量是造成差异的主要原因[22]。本研究根据油脂的质量指标、脂肪酸组成、总酚和总抗氧化活性，对酶处理前后橄榄油品质的变化进行深入分析，并对其进行分类，根据主成分综合得分计算最优的酶及添加量。主成分分方差贡献率为51.38%，与亚油酸含量、油酸含量、亚麻酸含量、总酚以及总抗氧化活性呈正相关，后橄榄油的品质变化。如图3B所示，所有橄榄油样品可分为三类，未添加酶的橄榄油样品与加酶处理后的橄榄油样品在PC1和PC2方向上均相差较大。添加0.5%纤维素酶的橄榄油样品的总酚及抗氧化活性最高，因此其PC1得分远大于其他样品。此外，由于添加0.5%纤维素酶得到的橄榄油过氧化值和K232较低，因此添加0.5%纤维素酶能有效提高橄榄油的总酚、抗氧化活性和氧化稳定性。142CP亚油酸亚油酸%总酚FRAPABTS亚麻酸%K270过氧化值游离酸度油酸%AK232-1.0-1.00.00.5-0.5-1.00.00.5PC1(51.38%)BBA-2图3基于橄榄油质量指标、化学组成和抗氧化活性的主成分分析载本研究选用重庆地区产量较稳定的豆果品种，在橄榄融合过程中加入不同剂量的酶，研究酶处理前后橄榄油质量指标、脂肪酸组成、总酚以及抗氧化活性的变化。结果表明，酶处理可以有效降低橄榄油中的氧化产物，并增加橄榄油中油酸的比例。虽然酶处理后的橄榄油游离脂肪酸的含量会有小幅提升，但是所有橄榄油样品的游离酸度均在IOOC（2003）所规定的范围内。此外，果胶酶和纤维素酶能有效降解橄榄细胞壁，减少亲水酚类物质与细胞壁多糖的络合，有助于橄榄果皮中的游离酚的释放，从而提高橄榄油中总酚含量及抗氧化活性。结合主成分分析的结果，确定了在橄榄融合的过程中添加0.5%纤维素酶（w/w）得到的橄榄油总酚、抗氧化活性和氧化稳定性最高。[1]黄帅,王强,应瑞峰,等.拉曼光谱技术在橄榄油掺伪及品质鉴定中的应用研究进展[J].食品工[5]ALIAKBARIAN,B,DeFAVERI,D,CONVERTI,A,etal.Optimisationofoliveoilextractionby[7]SERVILI,M,SELVAGGINI,R,TATICCHI,A,etal.Volatilecompoundsandphenoliccomposition[9]LEONE,A,ROMANIELLO,R,JULI[10]TAMBORRINO,A,ROMANIELLO,R,CAPONIO,F,etal.Combinedindustrialoliveoilextracti