高速逆流色谱溶剂体系筛选及其联用技术课件

高速逆流色谱溶剂体系筛选及其联用技术

报告内容一、溶剂体系筛选方法二、高速逆流色谱联用三、关于上海同田生物一、溶剂体系筛选方法

基本原则:不造成样品分解或变性

对样品有较大溶解度固定相在分离柱中有较好保留样品在两相溶剂系统中有合适的分配系数溶剂体系的筛选方法

1.分配系数（K

）法

K＝Cs/CmCs为溶质在固定相中的质量浓度Cm为溶质在流动相中的质量浓度Cs和Cm的比值可通过HPLC测得

理想的分配比值k=0.5~2，允许0.2~5CsCm两种溶质分离因子：

α＝K1/K2（>1.5）

当Cs

/Cm

＜＜0.5时，出峰时间太快，分离度较差当Cs

/Cm

＞＞2时，出峰时间太长，且峰形变宽芦荟提取物的HPLC图谱实例（HPLC法测K值）芦荟未知物芦荟苷A芦荟苷B芦荟提取物的HSCCC图谱芦荟苷B芦荟苷A芦荟未知物对已知化合物类别的物质可参考相关文献，在文献提供的体系的基础上进行调整对未知样品，可采用氯仿-甲醇-水=10-3-7或正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水=1-1-1-1两个极性分布范围较广的体系先进行尝试，也可以根据样品的极性选择相对应的溶剂体系，再根据目标组分的分配系数进行调整

2.经验法

溶剂体系根据极性可以分为三类：疏水性（石油醚体系，正已烷体系）

中等疏水性（氯仿体系，甲基叔丁基醚体系）亲水性（正丁醇体系，乙酸乙酯体系）

3.分析型HSCCC法优点：分析时间短溶剂消耗少进样量小，节省样品确定的体系可直接用于放大制备，重现性佳仪器：TBE-20A

转速：1600r/min

流速：0.5ml/min

样品：8％沙棘提取物

体系：正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水

洗脱方式：下相作为流动相实例（分析型HSCCC法）

0.8：1.2：1.2：1.2

0.8：1.2：1.2：1.5

正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水（0.8：1.2：1.2：1.7）

槲皮素

山萘酚

异鼠李素

HSCCC工艺重现性TBE-20A分析型HSCCCTBE-300B半制备型HSCCCTBE-1000A制备型HSCCC

Ito认为溶剂体系的筛选可以从氯仿-甲醇-水(2:1:1)开始，如果分配系数落在0.2-5的范围内，通过调整可以获得满意的分配系数。如果样品主要分布在非水相的下相中时，应尝试下表中箭头向上的体系，如果样品主要分布在上相时，则应试验相反方向的体系。BHAW方法是将非极性溶剂体系正已烷-乙腈（1:1）和极性溶剂体系正丁醇-水（1:1）结合起来，形成了7种多元溶剂体系，编号为-3～+3首先试验0号溶剂体系，以确定下一步试验的方向。如果样品倾向于极性的水相，应该进一步实验0～+3号正方向的体系，否则应该试验0～-3号反方向的体系这组溶剂的特点是紫外透明性很好小结：溶剂体系的选择是HSCCC分离中最关键也是难度最大的一个环节，一般从样品的溶解度，通过参考文献及常用体系,测定K值等来筛选溶剂体系，然后再通过上述提到的各种方法进行调整。

随着逆流色谱技术的普及，越来越多的人致力于体系筛选的研究工作。注意事项：ÄKTA系列设备的出场设置的最高压力为1MPa，适合HSCCC的0～2MPa压力范围；如不是，需要设置最高压力为1～2MPaÄKTA系列的连接接头为M5型号，而HSCCC为M6型号接头，所以连接时需要使用转换接头2.HSCCC与ELSD的联用技术优势：基于样品的浓度梯度洗脱时基线稳定，无溶剂峰可用于检测挥发性低于溶剂的任何化合物HSCCC-ELSD联用技术已成功用于脂肪酸，生物碱，皂苷类，萜类，甾体类等的分离

注意事项：ELSD连接接头为M5型号，而HSCCC为M6型号，所以连接时需要使用转换接头(厂家提供)半制备型和制备型HSCCC与ELSD检测器联用时，需用分流器实现同时检测与馏分的收集分流器解析图三通管HSCCC组分流出口调速阀组分收集分流－进入ELSD检测器分流－进入收集器三通管3.HSCCC-ESI-MS联用技术高速逆流色谱与热喷雾式质谱联用法是一种新近发展起来的、具有适用范围广和灵敏度高等特点的分析方法可直接用于复杂样品中有关成分的鉴别和测定不需要对流出液做任何分离就可用于鉴定，降低了分离过程对样品造成污染的可能性适用于分析非挥发性或热不稳定性物质分析速度快

HSCCC-ESI-MS

Oka等解决了HSCCC与质谱联用的根本问题即接口问题，设计了T型连接器，发现联用并不影响色谱的分离和质谱的分析HSCCC-ESI-MS联用技术已成功地用于同时在线分离和分析丹参酮ПA，EGCG，三萜酸，多肽，多酚类和黄酮类等HSCCC能够获得高的溶质-溶剂比的流出物，从而使流动相吸收红外光谱的问题得到缓解高速逆流色谱与傅里叶红外光谱的联用只需要一个简单的流动池接口，不需要其他附加的去除溶剂的方法4.HSCCC-FT-IR联用技术优点：可以在分离的同时获得被分离物的结构信息缺点：需要较大的样品量（每种组分0.2-1mg）Romanach和DeHaseth应用HSCCC-FT-IR联用技术成功地对苯酚、硝基苯酚以及乙酰苯酚等进行了分离与鉴定，在线记录相应的IR光谱小结：随着HSCCC的普及，HSCCC与多种其他技术联用，为HSCCC的应用扩展了更大的空间。三、关于上海同田生物技术有限公司

公司位于上海张江科技园，占地约30亩，建筑面积约20000平方米，总投资人民币6000万元。

2008年11月25日，上海市高新技术企业认定办公室公告，上海同田生物技术有限公司被认定为上海市2008年第一批高新技术企业。

公司致力于高速逆流色谱仪（HSCCC）、高纯度天然产物有效成分单体、天然药物原料/中间体的研究开发、生产和销售。

作为多分离柱高速逆流色谱仪国家新型专利的拥有者、高速逆流色谱领域的领导者，我们与通用电气医疗生物科学中国有限公司（GEHealthcareBio-sciencesco.,ltd.）建立了长期的合作伙伴关系。TBE300B＋ÄKTAPrime在高速逆流色谱技术领域，公司所研制并批量生产拥有自主知识产权的新型多分离柱高速逆流色谱仪，性能稳定可靠，有分析型、半制备型、制备型等7种不同产品：

国内部分代表客户名单：香港赛马会中药研究院香港大学植物系中国科学院过程工程研究所（北京）中国科学院植物研究所（北京）国家中药制药工程技术研究中心（上海）山东绿叶天然药物研究开发有限公司山东聊城大学化工学院

泰国德国

公司于2008年底已在西班牙，比利时，韩国，泰国，新加坡，瑞士，南非，捷克，意大利，印度等十一个国家设立了代理商。中国对照品行业领导者，ISO9001：2000质量管理体系认证企业长达10年的对照品研发及标准制定经验同田对照品均通过严格的质量检测，附HPLC检测报告，大部分产品可提供NMR,MS等图谱。银杏内酯B银杏内酯A银杏内酯C部分对照品获得国家质量监督检验检疫总局颁发的标准物质证书天然植物<银杏,大豆>单体提取物上海市高新技术成果转化项目<石杉碱甲>上海市高新技术成果转化项目同田对照品质量目前已得到美国，德国，瑞士，英国，新加坡等多家