胶体金培训资料课件

胶体金快速检测卡的研制及应用胶体金组李晓第一页，共四十四页。主要内容胶体金的结构及性质1胶体金的制备2胶体金检测卡的组成3胶体金检测卡原理4胶体金检测卡产品介绍5第二页，共四十四页。1.胶体金的结构及性质1.1胶体金的概念

胶体金：指的是粒径在1～100nm之间能够均匀、稳定地、分散在液体中的金纳米颗粒，因其水溶液呈胶体状，因此称之为胶体金溶液。第三页，共四十四页。1.胶体金的结构及性质1.2胶体金的结构

胶体金是由一个基础金原子核与包围在外层的负离子层（AuCl2-）构成，呈球形(小颗粒)或椭圆形(大颗粒)。胶体金颗粒最外层可以吸附大量的正离子，能够均匀的分散在溶液中。第四页，共四十四页。1.胶体金的结构及性质1.3胶体金的性质（1）外观：随着胶体金粒径的逐渐增大，胶体金溶液的颜色从橙色逐渐变为紫色。（2）特性：由于胶体金表面呈负电性，能够与表面带正电荷的蛋白（抗原、抗体）通过静电作用结合进行标记。第五页，共四十四页。2.胶体金的制备

2.1制备方法（还原法）：采用还原剂将氯金酸（HAuC14）还原成胶体金，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。柠檬酸钠加热煮沸氯金酸（HAuC14）胶体金溶液第六页，共四十四页。2.2注意事项：（1）玻璃器皿的清洁制金前，玻璃器皿先用王水或铬酸溶液浸泡24小时，用自来水冲洗干净，然后依次用清洁剂洗涤3次，自来水冲洗3次，蒸馏水冲洗3次，双蒸水冲洗3次。2.胶体金的制备胶体金溶液澄清透亮，颜色均一，无异物、无漂金现象。第七页，共四十四页。2.胶体金的制备（2）试剂的配制制备胶体金需要配制的氯金酸溶液和柠檬酸三钠溶液必需使用双蒸水。

氯金酸溶液可以存放在4℃冰箱中，保存1年左右。还原剂柠檬酸三钠溶液需要新鲜配制。第八页，共四十四页。

3.1结构：主要由样品垫、金垫、硝酸纤维素膜（NC膜），吸水垫4个部分组成，从下至上依次首尾互相衔接，粘贴在PVC底板上。3.胶体金检测卡的组成第九页，共四十四页。3.2作用：⑴样品垫：检测样本滴加位置，对检测样本具有一定的过滤和缓冲作用，降低样本中离子强度或者酸碱度对检测结果的干扰。⑵金垫：将胶体金标记抗体通过干燥固定在玻璃纤维素膜上，是追踪抗体与抗原的反应。⑶硝酸纤维素膜：膜上预先包被上检测线和质控线，能够与胶体金标记物发生免疫反应相结合，使胶体金在检测线发生聚集，根据检测线的显色状况进行判读结果。⑷吸水垫：通过吸水作用使液体样品向上流动，带动金垫上的金标抗体向上移动，从而与检测线的抗原发生反应。3.胶体金检测卡的组成第十页，共四十四页。3.胶体金检测卡的组成第十一页，共四十四页。3.胶体金检测卡的组成3.3制作过程（1）胶体金的制备将氯金酸加热煮沸，用柠檬酸三钠还原制成粒径约为40nm酒红色的胶体金溶液。胶体金溶液澄清透亮，颜色均一，无异物、无漂金现象。第十二页，共四十四页。3.胶体金检测卡的组成胶体金pH调至8.0标记抗体封闭离心复溶（2）胶体金的标记

0.2mol/LK2CO3适量抗体BSA或PEG12000转/分封闭多余的游离胶体金，稳定胶体金标记物将胶体金标记物沉淀将胶体金标记物重新溶解第十三页，共四十四页。（3）金垫制备将标记好的金标复合物喷涂在玻璃纤维素膜上，在干燥间或烘箱中37℃将其烘干。（4）样品垫制备将样品垫处理液浸涂在玻璃纤维素膜上，在干燥间或烘箱中37℃将其烘干。3.胶体金检测卡的组成第十四页，共四十四页。（5）印膜制备将硝酸纤维素膜（NC膜）贴在PVC底板上，将印膜机的C,T线调整到合适的距离，然后进行印膜，最后将印好的膜放在干燥间或烘箱中37℃将其烘干。3.胶体金检测卡的组成第十五页，共四十四页。（6）组板将吸水垫和制备好的金垫、样品垫裁切至合适的宽度，与印好C,T线的硝酸纤维素膜贴在PVC板相应的位置。3.胶体金检测卡的组成组装好的大板第十六页，共四十四页。3.胶体金检测卡的组成（7）切条根据检测卡卡槽的宽度，将组装好的大板裁切成一定宽度的检测条，裁切宽度均一，无压痕，无划伤。第十七页，共四十四页。3.胶体金检测卡的组成（8）包装将裁切好的检测条压入检测卡壳内，配上吸管和干燥剂装入铝箔袋内，并密封好，按照一定的规格装入包装盒内。第十八页，共四十四页。竞争法基于检测小分子半抗原和包被抗原对胶体金标记抗体的竞争关系，主要是针对食品安全药物残留快速检测产品。原理夹心法基于包被抗原（或抗体）与胶体金标记抗原（或抗体）能够与检测抗体（或抗原）形成夹心复合物。主要是针对动物疫病检测产品。4.胶体金检测卡的原理第十九页，共四十四页。4.1竞争法4.胶体金检测卡的原理Y1:Clen单克隆抗体T:Clen-BSAY2:羊抗鼠抗体第二十页，共四十四页。预先在硝酸纤维素膜上的检测线（T）和质控线（C）分别包被上盐酸克伦特罗抗原（Clen-BSA）和羊抗鼠二抗，将胶体金标记克伦特罗免疫鼠抗体并固着在玻璃纤维上制成金垫，组装成试纸条。将检测的尿样滴加在样品垫上，当尿样中盐酸克伦罗达到一定的浓度时，即于固着在载体上的胶体金标记抗体结合，从而阻止其与固着在检测线（T）的抗原结合，无法在检测区形成紫红色条带。若尿样中不含盐酸克伦特罗（Clen)或其代谢物时，胶体金标记抗体与检测区的抗原结合，在检测线（T）形成紫红色条带。样品和金标记复合物继续往上移动，在质控线（C）上与包被的羊抗鼠二抗结合，在质控线（C）上形成一条紫红色条带，证明本检测卡有效。无论尿样中是否含有盐酸克伦特罗（Clen)在质控线（C）均应出现一条紫红色条带。第二十一页，共四十四页。结果判定：阴性:检测线(T)与质控线(C)都出现，表明样品中不含有盐酸克伦特罗或其残留量低于检测限。阳性:只有质控线(C),无检测线(T)，表明样品中盐酸克伦特罗的浓度高于检测限。无效:在质控线（C）处，无紫红色条带出现，判定为试纸条无效。第二十二页，共四十四页。4.2夹心法4.胶体金检测卡的原理第二十三页，共四十四页。预先在硝酸纤维素膜的检测线（T）上和质控线（C）分别包被上犬细小抗体和羊抗鼠二抗，将胶体金标记的犬细小免疫鼠抗体固着在玻璃纤维上制成金垫，组装成试纸条。将检测样本加入加样孔内，由于层析的原理向上移动，当遇上干燥的金标复合物，将其溶解，并带着金标复合物继续往上移动，至硝酸纤维素膜的检测线。如果样品中有犬细小病毒抗原存在，包被在检测线上的犬细小抗体和胶体金标记的犬细小抗体与样品中的犬细小病毒抗原将会在检测线上形成一个夹心的免疫复合物，呈一条紫红色条带，判定为阳性。若感染犬细小病毒越严重，样品中犬细小病毒含量就越高，条带颜色就越深。如果样品中没有犬细小病毒，检测线（T）上没有色带出现，判定为阴性。样品和金标记复合物继续往上移动，在质控线（C）上与包被的羊抗鼠二抗结合，在质控线（C）上形成一条紫红色条带，证明本检测卡有效。第二十四页，共四十四页。结果判定：阳性：在检测线（T）处，质控线（C）处，各出现一条紫红色条带，判定为阳性，表示样品中含有犬细小病毒。阴性：在质控线（C）处，出现一条紫红色条带，检测线（T)处未出现一条紫红色条带，判定为阴性，表示样品中不含犬细小病毒。无效：在检测线（T）处，质控线（C）处，都无明显条带出现，判定为检测卡无效。第二十五页，共四十四页。5.胶体金检测卡产品介绍5.1产品特点：方便：检测不需依赖仪器设备；快速：5-10分钟即可获得检测结果;灵敏：检测限可达到ng/ml;准确：无假阳、无漏检；现场：不受场地要求限制，可随时随地进行检测；大批量:能够同时检测大量样本。第二十六页，共四十四页。5.2产品种类食品安全及兽药残留快速检测产品第二十七页，共四十四页。瘦肉精快速检测卡瘦肉精产品是本公司金标产品中最成熟的产品，也是市场上使用量最大的产品，瘦肉精是养殖场、屠宰场对饲料和猪肉的必检项目，该产品具有以下几个优点：

（1）良好的稳定性。经过37℃、45℃加速破坏实验，和室温存放稳定性实验结果验证，该产品在室温存放18个月后，仍然具有准确的检测结果。

（2）较高的灵敏度。盐酸克伦特罗的灵敏度最高可达2ppb，莱克多巴胺的灵敏度最高可达3ppb，均能满足目前农业部对瘦肉精检测最高限量要求。并且高灵敏度的假阳性率在5%以下。

（3）检测时间短，瘦肉精产品阴性显色深，且出线快，1-2分钟即可明显看到检测线，3-5分钟能够很容易判读结果。第二十八页，共四十四页。黄曲霉B1快速检测卡饲料在自然条件下污染的黄曲霉毒素主要包括B1、B2、G1及G2四种，其中B1最多、G1次之,B2和G2很少。因为黄曲霉毒素B1（AFB1）毒性与致癌性最大，一般以AFB1作为饲料和粮食中黄曲霉毒素的含量评价时的主要指标。中国食品卫生标准中规定玉米、花生、花生油中黄曲霉毒素B1允许量为≤12μg/kg（ppb）。

本公司生产的黄曲霉毒素B1快速检测卡能够对养殖场使用饲料中黄曲霉毒素B1进行快速检测。该产品具有以下几个优点：

（1）黄曲霉毒素B1快速检测卡的灵敏度为5ppb，完全满足国家食品卫生对黄曲霉毒素B1的检测要求。样品处理后可根据不同的需求，可以将检测限灵活调整（10-50ppb均能满足）。

（2）通过在养殖场采集19种不同类型的饲料对该产品进行验证，对于不同类型的饲料可选用不同的样品处理方法，能够避免样品的干扰和漏检。

（3）样品提取方法简单，无需用特殊的试剂和复杂的仪器设备，为客户使用提供了方便。第二十九页，共四十四页。三聚氰胺快速检测卡三聚氰胺属于化工原料，是不允许添加到食品中的，对三聚氰胺在乳与乳制品中限量要求，我国规定在婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1mg/kg（1000ppb），高于1mg/kg的产品一律不得销售。液态奶（包括原料乳）、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg，高于2.5mg/kg的产品一律不得销售。本公司生产的三聚氰胺快速检测卡针对乳及乳制品中三聚氰胺的检测具有以下几个优势：

（1）样品移行速度快，选用合适的硝酸纤维素膜，奶样在2-3分钟即可流过整个视窗。

（2）样品无需过滤或离心处理，该产品的选用特殊材质的样品垫，能够过滤粘稠的液态奶样本，不影响检测结果。

（3）产品灵敏度为500ppb，对国家要求婴儿奶粉和液态奶中三聚氰胺的检测均能达到要求。第三十页，共四十四页。动物疫病快速检测产品第三十一页，共四十四页。宠物疫病快速检测卡本公司研发生产的犬瘟热、犬细小抗原快速检测卡采用国外进口原料，经过大量临床样品筛选验证，该检测卡具有检测灵敏度高、检测速度快、结果准确等优点，而且检测结果与韩国安捷、韩国瑞必诊、美国衡健、上海快灵等多家产品比对，层析速度快，检测结果符合率100%，无假阳无漏检样本。第三十二页，共四十四页。猪病抗体快速检测卡本公司研发生产了猪瘟、猪蓝耳、猪伪狂犬、猪口蹄疫等猪病抗体检测卡。用于养殖场对猪群免疫抗体效价的快速检测，同时还可为兽医对猪病的临床检测提供参考。该产品具有以下几个优势：

（1）检测样本种类多，该产品能够检测猪血清、血浆或全血样本，采用特殊材料处理的样品垫能够将全血样本中的红细胞自动凝集过滤，检测背景和检测结果不受干扰。

（2）检测抗体效价清晰，该产品配有定制的比色卡，根据检测线的显色深浅，与比色卡上不同滴度的颜色深浅对照，确定免疫抗体的滴度水平。并根据抗体滴度判断是否免疫合格，是否需要加强免疫。

（3）检测结果准确，胶体金检测结果参考间接血凝实验和ELISA实验检测结果，并以此为判断依据，检测结果一致。第三十三页，共四十四页。禽白血病抗原检测卡禽白血病是由一些共同特征的病毒引起的，这些病毒对鸡能够能引起许多具有传染性的肿瘤。患有禽白血病的鸡通常有精神萎顿，全身衰弱，逐渐消瘦和贫血。病鸡食欲减少或废绝，腹泻，产蛋停止，禽白血病给养鸡业带来极大损失。禽白血病抗原快速检测卡采用双抗体夹心法原理和胶体金层析技术制成，用于检测样本泄殖腔分泌物中禽白血病抗原，用于禽白血病的辅助诊断。该产品具有以下几个优势：

（1）操作简单，无需特殊仪器设备，将采集的泄殖腔拭子在稀释液中混匀，即可进行检测。

（2）检测速度快，滴加样本后5分钟即可判读结果。（3）该产品针对禽白血病P27抗原检测，特异性好，灵敏度高，与国内外ELISA试剂盒具有同等的灵敏度，可达到5ppb。第三十四页，共四十四页。5.3产品使用的注意事项（1）产品属于一次性产品，不可重复使用（2）产品保存需要湿度<30%，干燥密封，因此产品开封后在1小时内使用（3）产品保存温度：4-30度，无需冷冻（4）建议使用新鲜尿液、血清或组织、饲料的提取标本（5）超过有效期，或保存不当，包装破损受潮的产品不能使用。（6）样本加液量过多，容易从膜表面漫过，造成冲样；样本加液量不足时，液体无法层析。（7）检测环境温度太低，或待测标本温度过低，如接近零度甚至更低，容易导致免疫反应失效。（8）待测标本太粘或杂质过多造成堵塞。（9）试条受损，如NC膜断裂、样品垫断裂、金垫丢失等导致层析失败。第三十五页，共四十四页。5.4常见问题分析（1）在检测中，C，T线颜色不一致，检测结果如何判断？答：根据说明书判读结果，对与竞争法的产品，若是消线法，只要C，T线在规定的时间内都显色，不管颜色是否一致，就可判为阴性，T线不显色则判为阳性。若是比色法，T线比C线深，判为阴性，T线比C线浅或者T线不显色，则判为阳性。对于夹心法的产品，只要C，T线在规定的时间内都显色，就可判为阳性，T线显色越深，表示阳性越强。第三十六页，共四十四页。（2）在使用检测卡过程中，能否用水或着其他液体做为阴性样本对照？答：不能，一方面因为检测的样本成分是很复杂的，用水作为阴性没有参考意义。另一方面对于不同的产品检测体系不同，选用的缓冲液也不同，其他厂家的缓冲液或者其他液体对产品的检测结果会有很大影响，容易造成假阳或者漏检等现象。第三十七页，共四十四页。（3）不同厂家的检测卡作比较时，能做几份标本就下结论判定哪家的产品好吗？答：不能，一般情况下，客户在判定产品的时候，会拿几份标本平行做一下试验。其实这样是不够全面的。判定试纸条主要的指标有灵敏度、特异性、稳定性、精密度等指标，其中灵敏度和特异性是最关键的。灵敏度的考评是就需要由不同样本做添加，还需要由高浓度的阳性样本做倍比稀释。特异性也需要做不同区域和特殊样本的检验。因为不同厂家的检测条虽然原理是相同的，但原料来源都不相同，做几份是不能反应检测条综合性能指标的。

第三十八页，共四十四页。（4）样品层析速度慢或者不发生层析原因分析：加样量太少（一般要求加样为2-3滴）。样本过于粘稠或有沉淀物（如血块）。该测试条已受潮失效。建议处理方案增加加液量或滴加少量辅助液。滴加少量辅助液，对样本进行预处理以去除沉淀。物（血清/血浆离心后使用，全血重新取样）。更换新测试条重新检测，测试条尽量现拆现用。第三十九页，共四十四页。（5）测全血时，有大量的全血样本析出，NC膜背景偏红，影响结果判读。原因分析该测试条NC膜严重受损（机械损伤）或断裂使用已溶血的全血标本建议处理方案更换新测试条重新检测。尽量使用新鲜全血进行检测。第四十页，共四十四页。（6）漏检率偏高（假阴