高等哺乳动物基因工程

第4章高等哺乳动物基因工程四、高等哺乳动物的基因转移三、高等哺乳动物的载体系统二、高等哺乳动物的受体系统一、高等哺乳动物基因工程的基本概念五、利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白六、基因治疗一、高等哺乳动物基因工程的基本概念高等哺乳动物基因工程高等哺乳动物细胞基因表达技术高等哺乳动物转基因技术转基因动物个体动物工程细胞哺乳动物遗传性状改良药物筛选研究评价模型人体基因治疗蛋白多肽物质大规模生产药物筛选研究评价模型二、高等哺乳动物的受体系统高等哺乳动物细胞的生长特性高等哺乳动物受体细胞的条件高等哺乳动物受体细胞的遗传标记常用的高等哺乳动物受体细胞高等哺乳动物细胞的生长特性（1）正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制形态依赖性：细胞称扁平状，并有长纤维网状结构上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活50代且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。有时，正常细胞会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状态称为细胞系形成，此时的细胞成为细胞系。高等哺乳动物受体细胞的条件（2）以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备下列条件

细胞系特征丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大规模培养遗传稳定性外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存

合适的标记便于转化株的筛选和维持

生长快且齐分裂周期短，生长均一，便于控制

安全性能好不合成分泌致病物质，不致癌

大多数正常的高等哺乳动物细胞并不能同时具备上述条件，癌细胞能满足上述前四项要求，但在安全性能上有欠缺。高等哺乳动物受体细胞的遗传标记(1)营养缺陷型的哺乳动物受体细胞5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）次黄嘌呤核苷一磷酸（HMP）次黄嘌呤核苷（HR）GMPAMP尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）胸腺嘧啶核苷（TR）嘌呤核苷酸生物合成途径嘧啶核苷酸生物合成途径次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）（TK）胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤（AP）氨基喋呤（AP）从头合成途径补救合成途径含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的受体细胞（tk

-）不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因tk能与之遗传互补含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）编码基因缺陷的受体细胞不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因hprt与之遗传互补（hprt

-）(2)哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记遗传标记编码产物筛选药物作用机理APH-

氨基糖苷磷酸转移酶 G418

APH灭活G418DHFR

二氢叶酸还原酶 氨甲喋呤

DHFR变体抗氨甲喋呤

HPH-

潮霉素B磷酸转移酶 潮霉素B

HPH灭活潮霉素B

TK-

胸腺嘧啶核苷激酶 氨基喋呤

TK合成TMPXGPRT-

黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 霉酚酸

XGPRT合成GMPADA-

腺嘌呤核苷脱氨酶 腺嘌呤木酮糖苷

ADA灭活Xyl-A

常用的高等哺乳动物受体细胞迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规模生产的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细胞（CHO），其优势有如下几个方面：遗传背景清楚，生理代谢稳定与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确基因转移和载体表达系统完善耐受剪切力，便于大规模培养被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞（GRAS）三、高等哺乳动物的载体系统人腺病毒DNA猴空泡病毒DNA（SV40）人乳多瘤病毒DNA（BKV）人牛痘病毒DNA人腺病毒DNA腺病毒科为线状双链DNA病毒，无包膜，呈二十面体，共有93个成员，分哺乳动物腺病毒和禽腺病毒两个属。目前已鉴定的人腺病毒（1）腺病毒的生物学特性有6个亚属，其中常用来构建载体的主要是C亚属的2型（Ad2）和5型（Ad5）病毒。腺病毒感染人细胞时呈裂解型，不致癌；但对啮齿目动物来说，绝大多数的腺病毒成员均能致癌。（2）腺病毒的基因组DNAITRITRE1E2E3E4IVa2VAL1L2L3L4L5腺病毒基因组DNA全长36kb，其包装上限为原基因组的105%，DNA两端各有一个反向重复序列（ITR）；E1-E4为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的表达调控有关，其中E3编码晚期基因的调控因子，L1-L5为编码病毒包装蛋白的晚期基因；IVa2和VA均为病毒RNA聚合酶的亚基编码基因。E3区缺失只会影响病毒颗粒的成熟，不影响基因组的复制功能，因而在构建载体时往往除去这个2.2kb的片段，使得载体的装载量提高到4kb以上。基因重排低外源基因与病毒DNA重组后能稳定复制几个周期（3）腺病毒DNA载体的特点安全性能好不整合人的染色体DNA，不会导致恶性肿瘤宿主范围广对受体细胞是否处于分裂期要求不严格使用效果好外源基因在载体上容易高效表达猴多瘤病毒DNA（SV40）

SV40属于乳多瘤病毒科多瘤病毒属，呈小型二十面体，由VP1、VP2、VP3三种衣壳蛋白包装而成，基因组为5224bp的双链环状DNA（1）SV40的生物学特性SV40可以与所有哺乳动物宿主细胞中的组蛋白H2、H3、H4结合，从而使其DNA形成类似核小体的微型染色体结构。

SV40感染猴细胞时呈裂解型，不致癌；但感染啮齿类动物后，便发生非同源整合而致癌。（2）SV40的基因组DNAt/T基因编码病毒的小抗原和大SV40DNAoriVP2TVP3VP1t抗原与病毒的致癌作用密切相关

SV40在裂解宿主细胞前的晚期状态时，每个宿主细胞含有105个病毒DNA拷贝，因此十分适合用于高效表达外源蛋白（3）SV40DNA-质粒DNA杂合载体的构建

重组的SV40DNA分子必须经过包装后才具有感染能力，因此插入的外源DNA片段不能太大。为了尽量提高SV40的装载量，必须删除一些基因片段，因此重组的SV40分子必须与野生型病毒共感染受体细胞，才能形成有感染力的重组病毒颗粒。AproriviralgenegptSV40oripV2-GPTpBR322pBR322SV40pV2-GPT是一种SV40DNA与大肠杆菌质粒DNA杂合的载体，其中gpt为细菌来源的谷氨酸-丙氨酸转氨酶基因，用于筛选重组子。该载体曾被成功地用于在猴肾细胞中表达有生物活性的兔b-珠蛋白.（4）利用SV40DNA载体表达外源基因的程序SV40载体病毒晚期基因启动子筛选标记ori缺陷的SV40辅助病毒去除细菌序列插入外源基因重组分子分离病毒DNA转化筛选增殖感染基因表达好外源基因能高效表达（5）SV40DNA载体的特点基因重排高病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象宿主范围窄只能转染猴细胞装载量较小人乳多瘤病毒DNA（BKV）人乳多瘤病毒（BKV）属于乳多瘤病毒科乳头瘤病毒属，其基因组为双链DNA，感染宿主细胞后基因不发生整合，独立于染色体而自（1）人乳多瘤病毒的生物学特性主复制，每个宿主细胞最高可达500个拷贝（2）人乳多瘤病毒表达载体的构建BKV-E.coli

穿梭载体BKVoriBKVgeneDREMMTPAp

rE.colioriSV40PNeor删除编码病毒核心蛋白和外壳蛋白的基因，并与大肠杆菌质粒拼接，构成穿梭载体，它不能整合，同时也不能形成成熟的病毒颗粒裂解受体细胞。安装细胞色素P450dioxin介导的增强子DRE，控制小鼠乳腺癌启动子MMTP，由其带动外源基因的表达。SV40来源的启动子控制Neor

标记基因，以G418筛选重组子。以此载体在人细胞系中表达b1-干扰素和单纯疱疹病毒B蛋白获得成功。人牛痘病毒DNA人牛痘病毒是一个大型DNA病毒，基因组长185kb，能在宿主细胞质中自主复制。以前外源基因插在病毒基因组的非必需区内，构建（1）人牛痘病毒的生物学特性出的重组病毒具有感染力，而且一经转染，外源基因即可在最邻近的病毒启动子的控制下高效表达。然而由于牛痘病毒基因组较大，体外DNA重组很困难，因此通常采用体内重组的方式进行。目前广泛使用的牛痘病毒表达系统是一种预先构建好的重组病毒其基因组上插入了一个可表达的大肠杆菌T7RNA聚合酶编码基因。在（2）人牛痘病毒DNA表达载体的构建外源基因导入受体细胞之前，先以上述的重组病毒感染细胞，使其大量表达T7RNA聚合酶，然后再将含有外源基因和T7启动子的细菌型重组质粒导入哺乳动物受体细胞，此时外源基因整合在受体细胞染色体DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表达出重组蛋白。人囊状纤维化基因就是采用这种战略高效表达的。（3）利用人牛痘病毒载体表达外源基因的程序牛痘病毒启动子T7RNA聚合酶基因T7启动子外源基因细菌重组质粒感染转化培养收集四、高等哺乳动物的基因转移哺乳动物细胞的物理转化法哺乳动物细胞的病毒转染法哺乳动物细胞的物理转化法利用物理方法转化高等哺乳动物细胞的主要优点是外源基因表达盒中不含任何病毒基因序列，这对外源基因表达产物的分离纯化减轻了负担。但外源基因表达盒进入受体细胞后，往往以多拷贝的形式随机整合在染色体DNA上，导致受体细胞基因灭活、外源基因不表达。哺乳动物细胞的物理转化法将待转化的DNA溶解在磷酸缓冲液中，加入CaCl2溶液混匀，此时DNA被包裹在磷酸钙晶体颗粒内；此时细胞膜形成吞噬泡，磷酸钙晶体局部溶解膜结构，DNA便进入受体细胞；（1）磷酸钙共沉淀法将上述制备的颗粒悬浮液滴入细胞培养皿中，37℃保温4-16小时弃去DNA溶液，加入新鲜培养基，继续培养7天即可筛选转化株。如果在外源DNA中掺入少量的受体细胞内源性DNA可以提高转化效率。利用磷酸钙共沉淀法转化肿瘤病毒DNA，可使正常细胞转化为癌细胞，这是人们对肿瘤发生机制的最早理解。将待转化的DNA溶解受体细胞悬浮液中，然后加入电击转化仪的样品槽内，两端施加瞬时高压电场，使细胞膜产生细小的缝隙，此时电击转化法常用于对磷酸钙共沉淀法无效的细胞类型，如生长在悬浮液中的淋巴细胞等。（2）电击转化法DNA片段便可不经过胞饮作用直接进入受体细胞。将待转化的DNA溶解与天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面活性剂的存在下形成包埋水相DNA的脂质体结构。合，DNA随即进入胞质和核内。利用上述程序曾将外源基因成功地导入了小鼠的淋巴细胞和HeLa（3）脂质体介导法将这种脂质体悬浮液加入到细胞培养液中，便会与受体细胞膜融细胞。通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配，然后杀死雌鼠，从其输卵管内取出受精卵；性原核内。上述程序多用于动物个体的转基因过程，由于必须单细胞逐一操（4）显微注射法借助于显微镜将纯化的DNA溶液迅速注入到受精卵中变大了的雄作，所以不太适用于基因的克隆和表达。

血影细胞是指哺乳动物的红细胞在机械作用、病毒诱导、低渗环境下发生溶血，血红蛋白大量溢出，最后形成仅被细胞膜包裹的细胞同时，外源DNA也容易进入。当上述外界条件消失后，红细胞膜又可恢复原来的通透性。因此，可先将外源DNA转入血影细胞，然后再将（5）血影细胞介导法核结构。在溶血过程中，红细胞膜的通透性大增，在血红蛋白溢出的血影细胞与受体细胞在适当条件下发生融合，从而将外源DNA转入受体细胞。哺乳动物细胞的病毒转染法以病毒DNA为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒颗粒共转染特定的受体细胞。这种方法具有定向性好、实验重复性佳、导入效率高等优点，但也存在一定的缺陷，如目前常用的载体宿主范围有限，往往无法转染一些具有重要经济价值的家禽和牲畜细胞等。五、利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体利用哺乳动物工程细胞生产人组织型纤溶酶原激活剂利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子VIII哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理基因扩增是外源基因在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一种特殊方式。氨甲喋呤（MTX）是动物细胞中的关键代谢酶二氢叶酸还原酶数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，dhfr基因均得以扩增。这些抗性细胞正是通过增加相关基因的拷贝数、提高关键代谢酶（1）通过强化基因扩增高效表达外源基因（DHFR）的特异性抑制剂，细胞培养物经氨甲喋呤处理后，绝大多的表达水平，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。更重要的是，扩增的区哺乳动物细胞内的基因扩增现象域远远大于dhfr基因本身，即与dhfr基因相邻的DNA区域同时被扩增。DHFR-MTX高效表达系统外源基因dhfr转染dhfr-细胞系单克隆培养转移0.05

mMMTX培养单克隆转移培养单克隆转移5

mMMTX0.25

mMMTX培养单克隆外源基因扩增至100拷贝GS-MSX高效表达系统

谷氨酰胺合成酶（GS）能解除甲硫氨酸亚砜（MSX）对动物细胞的毒害作用。先将带有GS编码基因的载体转入培养的哺乳动物细中不必使用GS缺陷型的受体细胞，而且在正常的MSX浓度下就能筛选到含有高拷贝外源基因的转染细胞，这是GS-MSX系统比DHFR-胞中，由于只有多拷贝的GS编码基因才能抗MSX，所以在转染过程MTX系统优越之处。在载体上安装病毒或细胞来源的强启Ap

rM13oriColE1oriCMVPPolylinkerGeneIntronSV40TPolyAsignal高效表达载体mRNA前体AAAAAAAAAmRNA动子以及有效的翻译元件，也是使外源基因高效表达的一种手段，如：细胞巨化病毒CMV的启动子动物珠蛋白基因的内含子SV40的终止子和polyA化信号序列

绝大多数哺乳动物细胞的表达型载体上携带内含子结构，因为mRNA前体的剪切能促进成熟mRNA向胞质的运输，有利于翻译。有的还含有各种信号肽序列。（2）利用哺乳动物工程细胞生产的重组蛋白迄今为止，已有大约300种重组蛋白药物正在进行临床试验，但在哺乳动物工程细胞中大规模生产的只有少数几种：b

干扰素 g

干扰素凝血因子VIII 凝血因子IX促红细胞生成素（EPO）

生长因子（hGH）白介素2（IL-2） 乙型肝炎表面抗原单克隆抗体 CD4受体组织型纤溶酶原激活剂（tPA） 利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体大多数恶性淋巴Neor鼠金属硫蛋白启动子b

肌动蛋白启动子抗体轻链cDNAb

肌动蛋白终止子pLdhfrSV40启动子b

肌动蛋白启动子抗体重链cDNAb

肌动蛋白终止子pH瘤细胞表面上都有一种特异性的糖蛋白campath用人源化的小鼠抗campath抗体治疗非霍金淋巴细胞瘤患者，效果良好。重组抗体采用DHFR-MTX系统表达。利用哺乳动物工程细胞生产人组织纤溶酶原激活剂第一个由重组哺乳动物dhfr启动子人tPAcDNA终止子细胞规模化生产的医用蛋白是治疗急性心肌梗塞的溶血栓药物：人组织纤溶酶原激活剂（tPA）。同样采用DHFR-MTX系统表达，受体细胞选用CHO系统。目前，用该工艺路线生产的重组人tPA已经商品化。信号肽编码序列此外，人tPA也可由重组大肠杆菌生产，但蛋白的重折叠效率低。利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子VIII

凝血因子VIII编码基因的缺陷与血友病密切相关。多年来，血友病病人都是使用从人血中分离纯化的凝血因子VIII生物制品进行治疗，然而由于人的血源污染乙肝病毒或爱滋病病毒，数千名使用这种血液制品的血友病人惨遭感染，其中10%的病人最终死于爱滋病而非血友病。

早在上述情况发生之前，人凝血因子VIII的cDNA便已被克隆和鉴定，血源的污染则加速了利用基因工程技术生产该药物的进程。与tPA相似，人凝血因子VIII也是一种结构复杂的大分子，必须通过重组哺乳动物细胞生产，但目前商品化了的重组人凝血因子VIII尚不能满足几代血友病人的大量需求。六、基因治疗

基因治疗的概念基因治疗策略基因治疗方法靶细胞的选择反义核酸基因治疗基因治疗的现状与前景基因治疗的概念

基因治疗：指应用DNA重组技术，将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗的目的。为达到这一目的，实施相应的策略。策略：直接基因治疗和间接基因治疗（1）直接基因治疗：纠正突变基因

在原位修复缺陷的基因，以达到治疗目的。为较理想的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力之中。（未实现）基因治疗策略

（2）间接疗法：

以正常的基因替代致病基因。导入外源正常基因，代替有缺陷的基因。而对靶细胞而言，没有去除或修复有缺陷的基因。用DNA重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的基因，使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的。

途径

就基因转移的受体细胞不同，基因治疗有两种途径：

（1）生殖细胞基因治疗（2）体细胞基因治疗（1）生殖细胞基因治疗将正常基因转移到患者生殖细胞（精细胞，卵细胞，早期胚胎）使其发育成正常个体。为理想的治疗方法，从根本上治疗遗传病，使其有害基因不能在人群中散播。

但还存在某些问题1）靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展；2）基因转移效率不高，只能用显微注射方法；3）只适用于排卵周期短而次数多的动物，很难适用于人类。（但目前辅助生殖技术的发展较为有效的解决了获取卵细胞的办法。一次可获取少者3-5个，多者十几个。）（2）体细胞基因治疗

将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传给后代。

措施正常基因转移至体外培养的体细胞，有效表达后，再回输到体内。正常基因导入靶细胞，定位整合到染色体上，准确的替换异常基因，是理想的措施。随机整合，非特定座位，只要有效的表达即可达到治疗的目的。体细胞基因治疗理论上不必矫正所有的体细胞。存在的问题对特定座位基因转移，目前还存在较大困难；随机插入可能引起后代的基因突变。基因治疗方法基因治疗的关键性步骤——目的基因的获得与转移

基因治疗首先获得目的基因通常从基因组中分离

基因克隆

↓

定位

↓

表达

↓

评价表达情况（1）目的基因的获得—正常基因的分离与克隆物理方法电穿孔法（electroporotion）将细胞置于高压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。周围基质中的DNA可渗进细胞，进而表达。

瞬间细胞细胞膜核膜通透性增加

高压脉冲

DNA渗入细胞

（2）外源基因的转移通过不同方法，将目的基因转移至受体细胞。显微注射法利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核

例：转基因动物的制备重组基因DNA

微注射（体外）

小鼠受精卵回植假妊娠

仔鼠

动物模型：转基因鼠

(每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传)clonesheepDolly体细胞提取核重组细胞回植Dolly卵细胞去核细胞

微粒子轰击法

利用亚微粒的钨和金能吸附DNA，并将其包裹起来形成微粒，通过物理途径获得高速度，微粒瞬间既可进入靶细胞，达到转移目的基因的目的，而不损伤靶细胞。该方法可使目的基因在皮肤、肝、胰、胃及乳腺等细胞中表达。化学法磷酸钙沉淀法：目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。磷酸钙+DNA→混合微细颗粒↓

沉淀反应20~30min

↓

细胞在沉淀物中暴露5~24h

方法简单，但转化效率低。脂质体法应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构——脂质体，包装外源基因，再与靶细胞融合，外源DNA导入靶细胞，使其表达。

DNA细胞融合转化细胞

PEG

仙苔病毒DNA脂膜同源重组法

同源重组：外源基因和染色体上的基因在同源序列间发生重组而插入染色体。

是将外源基因定位导入细胞的染色体上。

单交换

双交换

通过同源重组定点插入珠蛋白基因XbaIBstXIXbaIδβ△βneoXbaIBstXIδΔββneo正常基因座位带有珠蛋白基因的质粒

C重组后，插入外源基因片段带有——neo基因（新霉素抗性基因），重组后的细胞在含有neo的培养基中生长，没有插入新基因的细胞死亡，将有重组的细胞筛选出来。

病毒介导基因内转移是通过病毒为载体（vector），将外源基因通过重组技术与病毒重组，然后去感染受体细胞感染细胞重组病毒

逆转录病毒(RNA)

常用的病毒载体

DNA病毒逆转录病毒（retrovirus）

目前应用最多、最成功.病毒感染细胞后，其基因组RNA经逆转录产生双链DNA拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirus），前病毒转录产生的正链既是病毒RNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因组结构：

LTRLTRψgagpol

envU3RU5U3RU5

U3=增强子，R=启动子，U5=转录起始位点。

Ψ=病毒包装信号，gag=核心抗原，pol=逆转录酶，env=外壳蛋白。逆转录病毒载体优点：①高效感染宿主细胞，转染率可达100%②病毒基因和所载的外源基因都可能表达③宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留缺点

①病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段；②病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒具有强大的启动子和增强子，能使插入点附近的基因过度表达或失活，插入的外源基因可能不适当的表达；③逆转录病毒有致癌作用，可能使受体细胞癌变。根据逆转录病毒的缺点，人们有目的地将其改造，保留其优点，除去癌基因和病毒基因，保留LTR和ψ包装信号。受体载体转移法将含有目的基因的重组质粒和某些细胞表面受体能识别的特异性多肽（配体）形成复合物，通过细胞内吞途径达到转移基因的目的。重组质粒配体细胞膜复合物靶细胞的选择靶细胞是指接受外源Gene的体细胞选择靶细胞的原则：1）必须较坚固，便于体外培养和进行遗传技术操作；2）易于由人体分离又便于输回体内3）具有增殖优势，生命周期长（能存活几月至几年，或整个生命周期）4）易于受外源遗传物质转化。常见的靶细胞外周血T淋巴细胞上皮细胞内皮皮肤成纤维细胞造血干细胞——β地中海贫血、严重复合免疫缺陷病等基因治疗肝C——家族性高胆固醇血症、低密度脂蛋白病的基因治疗肌细胞反义核酸基因治疗反义技术：是指利用人工合成的反义RNA或DNA导入靶细胞，阻断Gene的转录或复制，控制细胞的中间阶段使编码蛋白的Gene不能转录为mRNA或阻断翻译相应蛋白。反义基因治疗

DNADNA

RNARNA

反义RNA

阻断表达

基因治疗的现状与前景体细胞基因治疗临床实验已经开始，生殖细胞基因治疗正在完善。进行基因治疗必须具备下列条件：选择适当的疾病，清楚疾病的发病机理，Gene的结构和功能。被纠正的基因已克隆，并清楚Gene表达与调控机制与条件。选择适当的受体细胞并在体外有效表达。安全有效的基因转移方法，以及供利用的动物模型。基因治疗实例1、复合免疫缺陷综合征的基因治疗（人类Gene治疗成功例子）ADA缺乏症——致死性疾病，患者由于腺苷酸脱氨酶（ADA）缺乏。ADA-Gene+vector（逆转录病毒）

重组分子患者TLyCIL-2刺激C分裂导入细胞生长分裂

10天

Gene表达

回输患儿体内

1~2月治疗一次,10个月患儿体内ADA水平达正常人的25%

2、乙型血友病XR，患者凝血因子Ⅸ缺乏，Ⅸ因子基因定位在Xq26.3~q27.2。临床表现，易出血，凝血时间长，轻伤、小手术后常出血不止。发病率为1/30000。例如：我国学者薛京伦实施的FⅨ的基因治疗。逆转录病毒载体

+FⅨcDNA

重组体

5`LTRFⅨneoSVPSO

LTR3`①导入仓鼠细胞（CHO）→FⅨ表达；②导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）→FⅨ表达；③91年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）→回植病人皮下→FⅨ基因表达，FⅨ基表达水平达正常人的5%。是我国基因治疗成功的例子。3、黑色素瘤的基因治疗肿瘤Gene治疗是人们十分关注的问题，进行了广泛的探索。研究发现，肿瘤浸润淋巴细胞——TIL，它积聚肿瘤部位，并在该处持续存在而无副作用，利用此特点协助治疗肿瘤。例：细胞因子基因治疗和肿瘤坏死因子基因治疗

①IL-2Gene