杂交瘤技术制备单克隆抗体

杂交瘤技术制备单克隆抗体杂交瘤技术制备单克隆抗体第1页单克隆抗体（McAb）：是由只识别单一抗原决定簇B细胞克隆产生同源抗体。

理化性状高度均一效价高只与一个抗原表位发生反应、生物活性单一含有高度特异性又易于大量制备杂交瘤技术制备单克隆抗体第2页怎样取得McAb?怎样大量取得McAb?需要克服哪些技术问题？杂交瘤技术制备单克隆抗体第3页理想抗体分泌细胞：含有合成和分泌抗体能力

含有大量无限生长特征杂交瘤技术制备单克隆抗体第4页

在1975年，Kohler和Milstein未起源于小鼠骨髓骨髓瘤细胞和啮齿动物能够分泌抗体细胞融合后形成杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞含有肿瘤细胞无限繁殖能力，也含有免疫细胞分泌抗体能力，以后将这种杂交细胞系统统称为杂交瘤（hybridoma）。

经过筛选，分离得到针对特异性抗原并含有所要求抗体亲和力杂交瘤细胞。在适当营养条件下，杂交瘤细胞能够生长和无限制性传代，而且能产生大量单一类型抗体及单克隆抗体。杂交瘤技术制备单克隆抗体第5页一、杂交瘤技术基础原理二、单克隆抗体制备三、单克隆抗体应用杂交瘤技术制备单克隆抗体第6页

一杂交瘤技术基础原理

利用聚乙二醇作为细胞融合剂，使免疫小鼠脾细

胞与含有在体外不停繁殖能力小鼠骨髓瘤细胞融为一

体，在HAT选择性培养基作用下，只让融合成功杂交瘤细胞生长，经过重复免疫学检测筛选和单个细胞培养（克隆化）,最终取得既能产生所需单克隆抗体,又能不停繁殖杂交瘤

细胞系，将这种细胞扩充培养，接种于小鼠腹腔，在其产生腹水中即可得到高效价单克隆抗体。杂交瘤技术制备单克隆抗体第7页流程杂交瘤技术杂交瘤技术制备单克隆抗体第8页1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可取得很好免疫效果2.可溶性抗原免疫原性弱，普通要加佐剂，可溶性抗原10-50ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔，2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可重复屡次）冲击免疫（融合前3天进行）选取6-12周龄Balb/c小鼠免疫方案杂交瘤技术制备单克隆抗体第9页不产生Ig重链和轻链HGPRT-与提供淋巴细胞动物品系相同小鼠骨髓瘤细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体第10页处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞或浆母细胞动物：6～12周龄20g～25g体重免疫脾细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体第11页细胞融合剂：PEG:分子量4000PEG是最常见细胞融合剂作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有利于细胞融合作用特点：不一样分子质量、浓度、作用时间、pH,可能直接影响融合效果细胞融合杂交瘤技术制备单克隆抗体第12页培养骨髓瘤细胞：对数生长久浑圆、透亮、均一、排列整齐防止细胞返祖：定时用8-AG处理细胞1-2×107免疫脾细胞制备：1-2×108无菌手术杂交瘤技术制备单克隆抗体第13页喂养细胞：常见小鼠腹腔巨噬细胞，5-8×106分泌细胞生长因子吞噬衰老细胞和微生物存活普通不超2周，不影响杂交瘤细胞纯化杂交瘤技术制备单克隆抗体第14页杂交瘤细胞选择性培养细胞DNA合成途经：1.替换路径：次黄嘌呤（H）HGPRT2.主要路径：氨基酸鸟嘌呤核苷酸谷氨酰胺（A-）尿核苷单磷酸胸腺嘧啶核苷酸TK3.次要路径：胸腺嘧啶核苷（T）杂交瘤技术制备单克隆抗体第15页HAT培养基：H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要路径T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞经过替换路径合成DNAHAT选择培养基原理杂交瘤技术制备单克隆抗体第16页HAT选择作用：淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成主要路径被A阻断骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成替换路径受阻杂交瘤技术制备单克隆抗体第17页杂交瘤技术制备单克隆抗体第18页克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目标是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。克隆化标准：尽早进行，重复4-5次阳性杂交瘤细胞克隆化杂交瘤技术制备单克隆抗体第19页有限稀释法(limitingdilution)软琼脂平板法(softagarmethod)单细胞显微操作法(micromanipulation)荧光激活细胞分类法法（fluorescenceactivatedcellsorter，FACS）克隆化方案：杂交瘤技术制备单克隆抗体第20页特点：不需任何特殊设备克隆出现效率高试验室常见方法方法：细胞悬液经过系列稀释每个培养孔含0.5～1个细胞有限稀释法杂交瘤技术制备单克隆抗体第21页在没有建立一个稳定分泌抗体细胞系时，细胞培养过程中随时可能发生细胞污染，分泌抗体能力丧失等“慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮

“快融”：取出马上浸入37℃～40℃水浴中，使其快速融化、复苏杂交瘤细胞冻存与复苏杂交瘤技术制备单克隆抗体第22页预防污染防止染色体丢失预防非分泌细胞过分生长预防细胞密度过高而死亡细胞冷冻意义杂交瘤技术制备单克隆抗体第23页杂交瘤细胞检定1.抗体分泌稳定性抗体连续传代法---保持稳定分泌特异性抗体2.细胞核学特征检验细胞分裂中期染色体---确保不丢失产生抗体基因染色体3.鼠源病毒检验细胞试验，动物抗体产生试验，鸡胚感染试验等---排除单抗制品病毒污染4.支原体检验荧光染色法，培养法，分子生物学法等—预防污染5.无菌试验直接接种法，薄膜过滤法杂交瘤技术制备单克隆抗体第24页

二单克隆抗体制备

经过重复克隆化取得抗体阳性杂交瘤细胞株应马上扩充培养（除及时冻存细胞外）。因屡次传代易引发染色体逐步丢失而使细胞产生抗体能力逐步减弱甚至消失，还应尽早使用取得抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。杂交瘤技术制备单克隆抗体第25页动物体内诱生方法：

操作简便，经济主要用于生产科研或诊疗用单抗腹水浓度可达2-5mg/ml实体瘤法、腹水制备法体外培养法：使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞工艺简单、易控制，可大规模生产浓度不高，200-500ug/ml悬浮培养法、固相培养法单克隆抗体产生杂交瘤技术制备单克隆抗体第26页腹水制备法杂交瘤技术制备单克隆抗体第27页预先腹腔注射降直烷或液状石蜡1-2周后注射（1～5）×106细胞1～3w形成腹水5-20mg/ml,1-10ml高滴度腹水杂交瘤技术制备单克隆抗体第28页抗体特异性判定：抗原类似物交叉反应Ig类型、亚类判定：双扩法或ELISA法McAb中和活性判定：动物或细胞保护试验McAb识别抗原表位测定：用竞

争结正当，测相加指数法McAb亲和力测定：ELISA单克隆抗体性质判定杂交瘤技术制备单克隆抗体第29页注意事项1.污染细菌，真菌，支原体2.杂交瘤细胞不分泌或停顿分泌抗体HAT中A失效；免疫原抗原性弱，免疫效果差；支原体污染；抗体非分泌细胞竞争性生长；染色体丢失杂交瘤技术制备单克隆抗体第30页预防办法1.大量保持和补充液氮冻存细胞原管；2.倒置显微镜经常检验细胞生长情况；3.不让细胞“过分生长”4.不让培养物不加检验任其连续培养几周或几月；杂交瘤技术制备单克隆抗体第31页抗体纯化：硫酸铵沉淀凝胶过滤法离子交换层析亲和层析杂交瘤技术制备单克隆抗体第32页硫酸铵沉淀

大量盐加入到蛋白溶液中，高浓度盐离子有很强水化力，可夺取蛋白质水化层，使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀析出血清50%饱和度硫酸胺

上清（清蛋白）沉淀（球蛋白）33%饱和度硫酸胺上清沉淀拟球蛋白r球蛋白杂交瘤技术制备单克隆抗体第33页凝胶过滤法干燥凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒，将蛋白质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时，大分子蛋白不能穿过凝胶网孔进入胶粒内，留在胶粒间隙溶液中，随洗脱液最先流出，小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内，受到凝胶阻留，向下移动较慢洗脱出来较慢，据此将不一样大小蛋白质分离出来。交联葡聚糖凝胶(Sephadex)琼脂糖凝胶(Sepharose)杂交瘤技术制备单克隆抗体第34页离子交换层析法DEAE纤维素：结合溶液中带负电荷蛋白质，又称阴离子交换剂CM纤维素：结合溶液中带正电荷蛋白质，又称阳离子交换剂杂交瘤技术制备单克隆抗体第35页亲和层析法将抗原