《基因表达》第二章 原核转录

第二章 原核转录

Transcription

InProkaryotesDNARNAPROTEINtoday’sfocus单链书写：5’→3’正链（＋）：非模板链负链（－）：模板链有义链（sensestrand

）：反义链（antisensestrand

）：2.1转录（Transcription）通过RNA多聚酶的催化作用从双链DNA合成单链RNA，合成的方向是5’3’，合成的序列信息与有义链一致RNA合成的模板是反义链RNA合成的必需组分：启动子（promotor），RNA多聚酶（RNApolymerase），NTPs,终止子（terminator）转录是基因表达的第一步，也是最关键的一步转录与复制的主要差异仅一条DNA模板链被转录RNA聚合酶不需要引物，能从头起始转录一个细胞的完整遗传信息中仅有少部分被转录成RNA转录远没有DNA复制精确2.2转录的基本过程

Basicprinciplesoftranscription起始（Initiation):RNA聚合酶和启动子延伸（Elongation):RNA聚合酶终止（Termination):终止子（terminator）起始InitiationRNA聚合酶与双链DNA（dsDNA）结合滑动直到发现启动子DNA螺旋解旋（unwind）在起始点（initiationsite，+1）开始合成RNAPromoter+1延伸ElongationRNA聚合酶一边沿DNA移动，一边合成RNA链。聚合酶前的DNA不停解旋而聚合酶后面DNA重新螺旋（rewind）在3’-端加上核苷酸（ribonucleotides）RNA链的生长方向是5’3’聚合酶沿反义链上的移动方向3’5’终止TerminationRNA聚合酶识别终止子，停止合成。终止子通常是发夹（hairpin）结构，有些终止子的需要辅助因子rho（ρ）转录复合物从DNA模板链上释放RNA链释放转录的起始延伸和终止Promoterbinding

DNAunwinding

RNAchaininitiation

RNAchainelongation

RNAchaintermination

Rho-dependenttermination

1.聚合不需要引物（primer）2.酶的活性依赖DNA，尤其是双链DNA作为模板

3.RNA合成需要Mg2+，合成方向5’3’4.所有RNA聚合酶缺3’5’外切活性，每掺入约104~105个核苷酸就会发生一个错配5.物种之间存在差异(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi2.3RNA聚合酶RNApolymeraseRNA聚合酶与DNA聚合酶比较RNApolDNApol模板双链DNA较好单/双链DNA引物需求不是起始启动子复制点（origin）延伸40nt/sec900bp/sec终止子合成的RNA模板DNAE.coliRNA聚合酶仅由一种聚合酶完成全部RNA的转录

酶的组成：2

’

全酶（Holoenzyme）=核心酶（Coreenzyme）+

全酶（2’）:RNA合成的起始核心酶（2’）:RNA合成的延伸E.coliRNApolymeraseBothinitiation&elongationInitiationonly36.5KD36.5KD151KD155KD11KD70KD465kdsubunitSizeaaSize（d）genefunctionalpha()32936511rpoA酶组装所需，与一些调节蛋白作用，也参与催化作用beta(β)1342150616rpoB催化作用：链的起始和延伸beta'(β')1407155159rpoC与DNA模板结合sigma(σ)61370263rpoD使酶定位到启动子上omega(ω)9110237rpoZ体外（invitro）恢复变性聚合酶的全部活性所必需的

亚基核心酶含有2个相同的组分由rpoA

基因编码核心酶组装所必需可能在启动子识别（promoterrecognition）中发挥作用

亚基由

rpoB

基因编码是RNA聚合酶的催化中心利福平（Rifampicin）与β亚基结合，阻断转录的起始。rpoB

基因的突变可以导致利福平抗性（resistance）利迪链菌素（Streptolydigins）抗性突变也定位在rpoB

基因，但抑制延伸而非起始β亚基可能包含2个结构域（domains

）分别对应于转录的起始和延伸’亚基由rpoC基因编码结合2个Zn2+

离子，可能参与酶的催化作用肝素（Heparin）与b’

亚基结合，在体外抑制转录肝素还与DNA竞争结合聚合酶b’

亚基负责与DNA模板链的结合

因子（

factor）许多原核生物拥有多个s

因子用来识别不同的启动子，E.coli最常用的是s70核心酶结合s

因子后转变为全酶s

因子可以降低核心酶对DNA一般位点(non-specificDNAsites)的亲和力(affinity)(10-4)，而增加对应启动子的亲和力来实现启动子识别转录起始后(RNA链有8~9nt)，s

因子从聚合酶中释放出来和RNA聚合酶的其他亚基比，细胞中s

因子的数量较少E.coli

s70

的启动子序列有-10序列和

–35序列2.4转录单位

atranscriptionunit

ATACGTATGC+1promoterterminatorTranscribedregionRNADNATranscriptionAntisensestrandAUACG2.4.1启动子启动子序列在40bp到60bp之间-55to+20：是聚合酶结合区域-20to+20：聚合酶紧密结合区，保护其免受DNaseI的消化上游一直到-40的位置：启动子功能的重要区域-10序列和-35序列：对启动子来说尤其重要---5-8bp---GCTATTGACATATAAT-----16-18bp-------+1-35sequence-10sequence启动子序列-10序列（Pribonowbox）6bp序列以-10点为中心一致序列（consensussequence）为TATAAT开始的2个碱基（TA）和最后的T在E.coli启动子里高保守6聚体序列与转录起始点+1的距离在5bp到8bp之间，这个距离重要-35序列保守的6聚体序列以-35点为中心一致序列为TTGACA开始的3个碱基（TTG）在E.coli启动子里高保守所有启动子里的90%，-35序列与-10序列的距离在16bp到18bp之间+1-7-12-31-365’mRNATTGACAAACTGT-35regionTATAATATATTA-10region79T44T96%T95A59A51APribnowbox84795345%82TTG64ACAconsensussequences全酶与启动子结合示意（over60bp）足迹法

DNaseIfootprintDNA序列单末端放射性标记分组与RNA聚合酶结合DNaseI不完全消化消化产物变性，分离标记的DNA片断凝胶电泳，放射显影DNaseIfootprint

用CRP和lac阻遏物分析lac启动子DNAa：Sequenceladderb：NoDNA-bindingproteinsaddedc：CRP（CAP）onlyd,e,f：CRP（CAP）andrepressorbothaddedg：RepressoronlyO是阻遏物结合区C是CRP结合区Science274,1930-1931（1997）转录起始——与启动子结合核心酶（2’）和DNA的结合无特异性（松散结合）

因子增强核心酶与启动子结合的特异性聚合酶沿DNA滑动寻找启动子的-35序列和-10序列，一旦发现即与之形成闭合复合体（closedcomplex）“闭合”意为DNA仍是双螺旋形式，闭合二元复合物的形成是可逆的，平衡常数KB=106-109M-1转录起始——DNA解旋由聚合酶执行的DNA解旋是必需的，这样反义链才能参与碱基配对对于多数基因来说，负超螺旋能够促进解旋以增强转录，但有例外（e.g.gyrase）与酶结合的一小块区域DNA被溶解后，转化为开放复合体（opencomplex），导致这一系列反应叫做紧密结合（tightbinding）对于强启动子，这个转化是不可逆的，速率常数K2=10-3-10-1sec-1

转录起始——RNA链的起始无需引物，由GTP（多数情况）或ATP开始插入头两个核苷酸，在他们中间形成磷酸二酯键。产生RNA、DNA和酶的三元复合物，速度常数K1约10-3sec-1最初的9nt合并无须聚合酶沿DNA移动和σ因子释放。任何一个碱基加入，聚合酶都可能释放RNA，导致流产起始（abortiveinitiations）产生流产起始后聚合酶又重新开始合成，RNA聚合酶往往需要经历多次的流产起始，产生一系列短的寡聚核苷酸。这点对于转录整体速率的控制非常重要起始成功后，酶释放σ因子。核心酶离开启动子以便另一个聚合酶可以开始，这个过程叫做启动子清除（promoterclear），最小时间需1~2秒（是个相对长的事件）启动子效率（efficiency）不同启动子间的序列差异很大，转录的效率可以相差1000倍-35序列，-10序列和转录起始点周围的序列都会影响到起始效率转录的头30个碱基序列控制RNA聚合酶对启动子的清除，因此影响到转录的速率和启动子的整体效率RNA链在起始反应中的分离有些启动子在正常情况下不足以强大，需要另外活性因子（activatingfactor）的参与才能起始转录。例如，Lac

启动子Plac

需要cAMP受体蛋白（cAMPreceptorprotein，CRP）对启动子突变的分析-10序列下降突变：T/A→G/C-10序列上升突变：G→A；GT→AA可以用解链效应解释-10序列下降突变：T/A→A/T-35序列下降突变：G/C→T/A与核心酶、σ亚基的结合有关转录起始点

Transcriptionstartsite90%的基因是嘌呤（purine）+1位点G比A更普遍通常起始位点的两侧是C和T（i.e.CGT或CAT）2.4.2延伸σ因子释放后形成pol-DNA-RNA三元复合体（ternarycomplex

），酶会沿着模板前进（启动子清除）RNA聚合酶不断解旋前端DNA，其后端DNA重新螺旋。转录泡（Transcriptionbubble，DNA解旋区，~17bp）RNA的3’部分与DNA反义链形成杂交螺旋（hybridhelix

约12bp）E.coli

聚合酶平均的移动速率~40nt/每秒，并与当时的DNA序列相关.起始与延伸2.4.3RNA链终止在终止子DNA序列处终止绝大多数终止信号（stopsignal）是RNA发夹（自身互补self-complementary）富含GC有益于这种结构的稳定终止有Rho-依赖型和非依赖型RNA分离→

DNA复性→RNApol释放终止子（Terminator）DNA的一段特殊序列，转录复合体在此分离Class1:ρ蛋白非依赖型自身互补组成茎环（stem-loop

）或发夹二级结构连续的腺苷酸（As）转录成RNA末端的一串尿苷酸（Us）Class2:ρ蛋白依赖型仅存在茎环或发夹二级结构E.coli.中一个ρ-非依赖的转录终止模型RNA转录本自身互补富含GC的序列稳定使聚合酶停滞茎环后紧接的一串

Us（4个或更多）减弱RNA和反义DNA链的结合力，利于分离ρ-依赖的终止有些基因的终止子需要辅助因子ρ蛋白来介导转录的终止

RNA

的3’末端无连续的URho结合到单链RNA的特别位点Rho水解ATP从RNA链的初生端向转录复合体方向移动，最终使聚合酶终止转录Rho蛋白（六聚体hexameric

蛋白）结合到RNA某个特定位点（72bp）沿初生的RNA链向RNApol复合体移动在Rho

-依赖的终止子处停止转录复合体解离转录终止点——λtR1研究tR1，ρ依赖的终止子不加ρ蛋白的体外转录产物大于16S，加入ρ蛋白，从右启动子（PR）转录的产物约9StR1转录终止点研究方法：RNaseT1（专一作用于RNA分子的GpN键，产物的末端为G-3’-P）分别消化9S和16SRNA9S产物（有5种产物）16S产物（仅一种产物）┅┅CAUACAUUCAAUCAAUUG在3’端的AUCAA任何一个核苷酸上都可以终止λtR1的突变分析活体内tR1的转录终止有利于溶原（lysogene），转录继续有利于裂解（lysis）有利于终止的突变