基因实验诊断培训班 分子生物学在临床中的应用

分子生物学在临床中的应用天津市第三中心医院刘树业P

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.Contents分子生物学简介分子生物学的发展历史分子生物学研究的内容分子诊断技术的发展分子生物学在临床医学中的应用P

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.一、分子生物学是生物学研究的一个分支v

分子生物学（molecularbiology）

从分子水平研究作为生命活动主要物质基础的生物大分子结构与功能，从而阐明生命现象本质的科学。重点研究下述领域：（1）蛋白质（包括酶）的结构和功能。（2）核酸的结构和功能，包括遗传信息的传递。（3）生物膜的结构和功能。（4）生物调控的分子基础。（5）生物进化。分子生物学是第二次世界大战后，由生物化学、遗传学、微生物学、病毒学、结构分析及高分子化学等不同研究领域结合而形成的一门交叉科学。目前分子生物学已发展成生命科学中的带头学科。P

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.生物学的发展过程分子水平整体水平细胞水平从整体水平到分子水平示意图P

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.分子生物学的定义v分子生物学：从分子水平研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律的科学。v医学分子生物学：

是分子生物学的一个重要分支，是从分子水平上研究人体在正常和疾病状态下的生命活动及其规律，从分子水平开展人类疾病的预防、诊断和治疗研究的一门科学。P

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.二、分子生物学发展历史1.

准备和酝酿阶段(

19世纪后期-

20世纪50年代初)v确定了蛋白质是生命的主要基础物质。19世纪末Buchner

兄弟:

证明了酵母细胞提取液能使糖发酵产生酒精，第一次提出了酶的名称，酶是催化剂。20世纪40年代:

提纯和结晶了一些酶如：尿素酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等，通过X射线衍射技术，从而证明了酶是蛋白质。随后陆续发现:

生命的许多现象都与酶和蛋白质相联系。P

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.v确定了生物遗传的物质基础是DNA1868年F.

米歇尔发现了核素；20世纪20-

30年代确认了自然界有DNA和R

NA两类核酸，并阐明了核苷酸组成；1944年Aver

y通过肺炎球菌转化实验证明了DNA是遗传物质；1952年Her

s

hey等人用同位素示踪技术标记T2噬菌体的蛋白质和核酸，感染大肠杆菌的实验进一步证明了DNA是遗传物质；P

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.2.现代分子生物学建立1953年Wat

s

on和Cr

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ck提出的DNA双螺旋结构模型是现代分子生物学诞生的里程碑，开创了分子遗传学基本理论建立和发展的黄金时期。遗传信息传递中心法则建立。1956年发现DNA聚合酶；1958年用同位素标记和超速离心实验为DNA半保留复制模型提供证据；1968年冈畸提出不连续复制模型；1972年证实了DNA复制开始需要R

NA作为引物，从而逐步完善了对DNA复制机理认识。P

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.DNA双螺旋结构模型的建立诺贝尔医学与生理学奖1962年P

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.James

Dewey

Watsonv1928

出生1944

16岁

芝加哥大学动物系1947

19岁

印第安纳大学研究生1950

22岁

博士学位

丹麦1951

23岁

剑桥

卡文迪什实验室1953

25岁

发表DNA双螺旋结构1962

34岁

获得诺贝尔奖Watson美国生物学家时年

25

岁P

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.P

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.3.20世纪70年代以来分子生物学飞速发展1970年，基因工程的兴起和发展1972年，Paul

Berg：体外DNA重组1973年，Herb

Boyer,

Stanley

Cohen：质粒与DNA重组方法克隆DNA1977年，Maxam-Gilbert,Frederick

Sanger：核酸测序方法1978年，基因工程生产人胰岛素1985年，Kary

Mullins，聚合酶链式反应（PCR）1997年，英国罗斯林研究所，培育出世界上第一例体细胞克隆动物多利羊P

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.RNAv1982年，美国Thomas

Cech在研究四膜虫rRNA自我剪接时发现，同时加拿大的SidneyAltman

发现RNase

P分子中的RNA组分有催化活性；1989年分享了Noble化学奖。

不仅拓宽了生物催化剂的领域，而且对RNA的生物学功能开创了一种历史性的新认识：RNA不仅具有储存和传递遗传信息的功能，而且还具有生物催化剂的功能，在一定程度上可以说，RNA一身兼有DNA和蛋白质两大类生物大分子的功能。P

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.GHtransgenic

miceDollysheepOb

mice降糖米GLP-1P

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.1982年，转基因动物1990年，基因治疗1990年，美国政府启动人类基因组计划（Huma

n

Ge

nomePl

an,

HGP

)2001年，公布了人类基因组草图2003年，完成人类基因组计划P

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.种属基因组（bp）5.1

x

1034.9

x

1043.0

x

1054.2

x

1061.3

x

1078.0X

1071.85

x1083.0

x

1093.3

x

1091.7

x

1010病毒SV40λ

噬菌体（

phage）支原体（mycoplasma）大肠杆菌（E.

coli）酵母（S.

cerevisiae）线虫（C.

elegans）果蝇（fruitfly）小鼠（mouse）人（H.sapiens）小麦（wheat）P

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.v

生物体的C值(C-value):基因组的大小通常以一个基因组中的DNA含量来表示。v

C值悖理(Cvalue

paradox)v

染色体外基因组(extrachromosomalgenome)v

1)

遗传图谱

2)

物理图谱

3)

转录图谱

4)

序列图谱v

营养基因组学（nutritionalgenomics）、环境基因组学（environmentalgenomics）、药物基因组学（phamarcogenomics）、病理基因组学（pathogenomics）、生殖基因组学(reproductivegenomics)、群体基因组学(population

genomics)、生物信息学（bioinformatics）等得以诞生。P

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.v人类基因组计划(

HGP)

全部基因测定的完成,

标志着分子生物学已跨入后基因时代。v由于基因组学不能阐明蛋白质表达的水平与时间、翻译后修饰、蛋白质与蛋白质相互作用等众多问题,

人们于是提出了蛋白质组学概念,

并以此来探讨细胞的结构与功能以及生命活动的本质和规律。P

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.v

基因敲除技术v

利用重组DNA技术将编码该蛋白的基因从有机体基因组中敲除掉观察缺失该蛋白的个体出现的表型变化，然后再推测蛋白在体内的可能功能。部分情况下这种敲除实验可以帮助我们了解被去除的基因所编码的蛋白分子在体内的可能功能。但很多情况下，结果是不明朗的。无法下肯定的结论。v

细胞转染技术v

将编码某种蛋白的目的基因（真核生物中一般使用的是对应蛋白的cDNA序列）插入到一DNA载体上，使之能够在待转染的细胞中表达，产生出具有活性的蛋白分子。然后观察转染后，所产生的蛋白对被转染细胞的行为的影响。并进而推测蛋白在细胞内的可能功能。P

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.v酵母双杂交系统v在过去的十多年的实践中已经被证明的确是一个研究蛋白-蛋白相互作用的系统。现在有人正试图将这种方法应用到对某种生物的细胞中全部的蛋白-蛋白相互作用的研究中去。P

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.v1995年WasingerVC等人提出了蛋白质组学(proteomics)的科学概念,

其主要任务是研究蛋白质的结构与功能。蛋白质是生命活动的最终体现者。v蛋白质组学（

Proteomics

）是从整体的角度出发来研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律的一门科学。P

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.蛋白质组学不同于传统蛋白质学科之处:v研究的目的是阐明生物体全部蛋白质的表达模式与功能模式v研究的内容十分广泛,涵盖了某个机体或某个细胞全部的蛋白质的结构和功能,包括鉴定蛋白质的表达、存在方式(化学修饰)、结构与功能的相互依赖关系,从某个生物体或某个细胞全部蛋白质(现已知单个细胞可容纳2万种蛋白质)整体活动角度揭示与阐明生命活动的基本规律P

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.蛋白质组学可分为三种类型:v蛋白表达蛋白质组学(

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essi

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cs

)v结构蛋白质组学(

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)v功能蛋白质组学(

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.蛋白表达蛋白质组学pr

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essi

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cs是定量研究蛋白质表达的技术,

如鉴定某种疾病的特异性标志蛋白,

应用它已从乙型肝炎病毒(

HB

V)

感染者血清,

原发性口舌鳞状上皮癌细胞组织中鉴定出生物标志蛋白。P

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.结构蛋白质组学st

r

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cs其主要任务是阐明蛋白质复合体或一个细胞器内的蛋白质的结构,例如阐明存在于线粒体、叶绿体、细胞核内的全部结构蛋白以及转录组中蛋白质—蛋白质的相互作用。P

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.功能蛋白质组学f

unc

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cs其主要任务是从分子水平分析亚细胞结构中蛋白质在功能上的组织构成及蛋白质表达谱,

如研究线粒体外膜、内膜、胞液、基质间隙的各种蛋白质定位,

并进行其功能分析。P

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.与研究核酸分子生物学相比,

完成以上三类蛋白质组学的研究任务,需要更为复杂的高端技术,

并需要通过生物学、分子生物学、生物物理学、生物医学与生物信息学多学科联合攻关才可望实现这个宏伟的目标。P

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.三、分子生物学研究的内容v核酸和蛋白的结构功能，基因组结构和功能，基因表达的调控；v生物大分子的相互作用及细胞间、细胞内的信号转导；v与理论相关的分子生物学技术体系P

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.vDNA和染色质结构对转录的调控v

DNA甲基化:在真核生物基因表达调控中，甲基化起着重要作用。一般认为，DNA甲基化与基因的表达呈反比关系。甲基化程度高，基因的表达则降低。去甲基化，又可使基因的表达增加。v

组蛋白对基因表达的抑制作用:组蛋白与DNA结合，可保护DNA免受损伤，维持基因组稳定性，抑制基因的表达。v

染色质结构对基因表达的调控作用:真核生物的染色质（chromatin）或染色体（chromosome）是由DNA与组蛋白、非组蛋白和少量RNA及其它物质结合而形成，具有核小体结构。v

基因重排（gene

rearrangement）:基因重排是指某些基因片段改变原来存在顺序，通过调整有关基因片段的衔接顺序，再重排成为一个完整的转录单位P

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.v

染色质的丢失:一些低等生物（如线虫等）的细胞发育过程中发现染色质丢失现象及高等动物红细胞在发育成熟中过程也有染色质的丢失，都是一些不可逆的调控。v

基因扩增（gene

amplification）:细胞在发育分化或环境改变时，对某种基因产物的需要量剧增，而单纯靠调节其表达活性不足以满足需要，只有增加这种基因的拷贝数（即基因的扩增或基因放大）来满足需要。P

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.v转录起始的调控v转录后的调控v翻译的可调控性及调控方式v翻译后加工的调控意义P

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.四、分子诊断技术的发展v利用DNA分子杂交技术进行遗传病的基因诊断P

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.细胞膜细胞核DNA基其

因它

诊诊

断断

的方

物法

质的

基区

础别

及与4基因诊断转录mRNA翻译蛋白质3免疫学诊断2生化诊断1形态学诊断临床诊断P

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.v

以PCR技术为基础的DNA诊断，不仅可以检测存在于宿主的多种DNA和RNA病原体载量，还可检测多基因遗传病细胞中mRNA的表达量。P

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.（1）等位基因特异性寡聚核苷酸（al

l

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de,

AS

O)

探针斑点杂交：

P

CR-

ASO该方法是诊断已知点的突变：需分别合成野生型和突变型探针．在基因诊断时，只需用P

CR扩增受检者目的DNA片段，再分别与上述探针杂交．P

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.（２）单链构象多态性（si

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mat

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on

pl

oymor

phi

sm,

SSCP)

分析是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法．DNA变性形成单链，在中性条件下长度相同的单链DNA,

如果碱基组成和(

或)

排列顺序不同,

形成的构象就不同,

这样就形成了单链构象多态性.

这些分子在非变性P

AGE中电泳中表现出不同的迁移率.SSCP特别适于分析小于400bp的

P

CR产物。据认为SSCP可以区分1bp的差异P

CR-

SSCP分析不能确定基因变异的内容，因此电泳后结果有差异后还需进行测序分析，确定变异性质P

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3)

限制性片段长度多态性（

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l

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h

pol

ymor

phi

sms,

RFLP）分析检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP的产生。P

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.v

以生物芯片（biochip）技术为代表的高通量密集型检测技术，生物芯片技术包括基因芯片，蛋白质芯片，组织芯片等，由于其工作原理和结果处理过程突破了传统的检测方法，不仅具有样品处理能力强、用途广泛、自动化程度高等特点，而且具有广阔和应用前景和商业价值，因此成为分子诊断技术领域的一大热点。P

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.v原位合成芯片（In

situ

syntheticGeneChip）Affymetrix公司vDNA微集阵列（DNA

microarray）斯坦福大学Patrick

Brown研究小组P

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.密度大于1000/cm2原位合成芯片SyntheticChips显微光蚀刻寡聚核苷酸合成合成DNA芯片**Affymetrix

Inc.AffymexInc.P

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.基因组研究临床疾病的基因诊断后基因组计划生物信息学药物研究开发法医学鉴定DNA芯片动植物检疫生物战剂检测P

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.分子诊断学的发展方向1）分子诊断的内容从传统的DNA诊断发展到核酸及其表达产物（mR

NA、蛋白质）的全面诊断；2）分子诊断的策略从利用分子杂交、P

CR等单一技术的诊断发展到有机组合多项技术的联合诊断；3）分子诊断的方法从定性诊断发展到半定量和定量诊断，核酸标记技术，特别是荧光标记技术的发展，荧光定量PCR技术等方法日益成熟；4）分子诊断的范围从单基因疾病（门德尔遗传性疾病，诸如白血病、早老症、血红蛋白病、甲型肝炎病毒，人类免疫缺陷病毒，人乳头瘤病毒等）的诊断发展到多基因病（肿瘤、心脑血管疾病、代谢病、神经系统疾病、自身免疫性疾病等）的诊断；P

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.五、分子生物学广泛渗透到医学各学科领域，成为现代医学重要的基础临床医学分子生物学P

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.通过致病基因的检测诊断疾病已经基本清楚基因突变与疾病发生之间的分子机制，相关的基因已被克隆，测序，并被定位在染色体上。如：一些与疾病有关的内源基因-

癌基因，抑癌基因和血红蛋白基因突变型。诊断方法：根据突变的基因序列设计探针.P

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.许多基因病，虽然它们的基因结构还没有阐明，但通过染色体分析已被定位在染色体的特定位置上，这些基因是通过检测与特定染色体位点连锁的遗传标记来发现的。原理：同一染色体上位置十分靠近的相邻基因或其它遗传标记，在遗传过程中分离的几率很低，常常一起遗传，形成连锁。可以通过一个或几个基因或遗传标记的分析，了解另一个或几个基因。P

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.90-

今:

表型克隆,不考虑基因在染色体上的位置信息,而是直接在疾病与正常样本之间寻找分子水平上的差异.方法：根据克隆到的一组基因制作相应的一组探针，用这组探针检测一组与疾病相关的基因来诊断多基因病P

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.表型克隆：对疾病相关的一组基因进行克隆一些多基因，多因素的疾病，如：肥胖，哮喘，高血压，冠心病，肿瘤，精神病，自体免疫性疾病等，由于疾病发生的原因复杂，不仅涉及多基因互作，还涉及基因与环境互作。不可能通过前面的方法来诊断，必须利用差异显示等技术找出正常人和疾病患者之间的差异序列，鉴定与疾病相关的多个基因，确定导致疾病的分子缺陷。P

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.分子生物学在遗传性疾病中的应用v

血红蛋白病血红蛋白病是由于血红蛋白合成异常所致的遗传性血液病。习惯上分为异常血红蛋白病和地中海贫血２类。1.

异常血红蛋白病是珠蛋白肽链结构的改变导致主要功能部位氨基酸的置换，影响Hb的溶解度、稳定性及生物学功能。２.

地中海贫血（α地中海贫血和β地中海贫血）是珠蛋白合成速率降低，导致链和非链合成的不平衡→多余的珠蛋白链沉积在Rbc膜上→改变了膜的通透性和硬度→导致溶血性贫血。P

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.Hb

Punjabα地中海贫血（

α珠蛋白合成↓）β地中海贫血（

β珠蛋白合成↓

）占我国新疆异常Hb病55.6%（1）产前诊断为主要目

每一民族或群体有的。特异突变类型谱，中国人主要突变类型有6种Hbβ链121密码单个碱基替代：GAA（Glu)

→CAA（Gln）→改变了EccRI一个识别位点分子基础大多数是α珠蛋白基因缺失所致。点突变、缺失或插入往往不涉及限制酶识别位点。DNA诊断：PCR扩增（

β珠蛋白第3个外显子和基因3´端DNA序列、全

谱分析，或PCR扩增电液体分子杂交C1限制酶PCR/ASO探针法（主要方法）长144bp）EcoRI酶切电泳分析。泳分析结果正常对照HbPuN

Job

144bp,40/104bp两种类型杂合子（同理扩增β40/104bp两个片段正常对照有正常杂交信号（C1）酶切片段不缺（C2）PCR产物有（C3）PCR/RFLP连锁分析法珠蛋白DNA片段MnlI酶谱分析

α地贫与正常结果反之。诊断HbE（

β26

Glu→Lys))RNA诊断：异常Hb病人mRNA的RT/PCR

RT-PCR介导的α珠蛋白

①PCR介导的产物测序知编码区碱基变化—推导相应氨基酸变化。mRNA定量↓。mRNA定量法。②mRNA的剪切缺陷检测P

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.P

CR技术应用实例（α地中海贫血）P

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.v

血友病是一种遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，由于正常凝血过程中血浆凝血的活力有缺陷所致。患者常因出血不止或继发病而夭折，治疗主要靠替代疗法，输入缺乏的血浆因子。重型血友病甲和乙的男性发病率为1/

5000~1/

50000。为甲型血友病和乙型血友病。主要特征：①也是X连锁遗传的凝血缺陷疾病。①是一组X连锁遗传凝血缺陷疾病。②约1%左右乙型血友病人FI

X基因缺失（因而在用替代疗法过程中会产生FI

X的抑制物）。③在非缺失（FI

X基因）型中，已发现398种不同的基因突变。②缺乏Xq远端的FⅧ（凝血因子Ⅷ）所致。③基因突变具极为异质性，与β地贫不同。（因子占X染色体全长0,

1%，共186kb包括26个外显子）不存在存族和群体特异性，几乎每一种不同的甲型血友病家系都具有自已独特的突变类型。（所以该病基因诊断不宜用P

CR/

AS

O探针直接检测点突变，而主要依赖RFLP连锁分析）（FI

X基因定位在Xq26→q27，全长34kb包括8个外显子）。P

DF

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nepr

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nt

.诊断情况：①

应

用

克

隆

化FⅧc

DNA①已克隆化FI

Xc

DNA和DNA片段，鉴定了FI

X基因的5个限制者多态性位点，故可用RFLP连锁分析进行产前诊断和携带者检测。与VI

I

I

基因连锁DNA片

段

和

DX1

8

、

St

14等分析了基因或旁侧的限制酶酶切位点多态性，并采用P

CR/

BCL

I

或

XbaIRFLP连

锁

分

析

法

进行了甲型血友病的产前诊断和携带者检测。②病例：乙型血友家系分析FI

X基因

发

现

某

患

者

缺

失

该

基

因5k

bDNA序列（第2~3外显子+第2内含子全部+部分第1，第3内含子）a、对该家系一例乙型血友病变高危妊娠产前基因诊断，诊断胎儿为男性乙型血友病患者。②用P

CR/

SSCP法检查了FVI

I

I

内

含

子

18

处BCL

I

的多态性。（终止妊娠对胎儿作凝血子测定和DNA分析、证

实

产

前

诊

断

正确。）b、对该孕妇第二胎产前诊断为女性乙型血友病基因携带者。（上海医遗传所淅江乙型血友病家系）P

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nt

.应用P

CR技术对4例DMD家系进行产前基因诊断v

Duchenne

型肌营养不良症(

Duchenne

muscul

ardys

t

r

ophy

,

DMD)

是一种具有严重危害的X染色体连锁隐性遗传疾病,

发病率为1/

3

500活产男婴。该病是由于肌营养不良蛋白基因dys

t

r

ophi

n突变导致肌细胞膜上骨架蛋白发生结构和功能改变所致。MD

患者常于5岁左右发病,约20岁因严重合并症死亡。v

该病尚无有效的治疗方法,

因此建立高效、准确、快速的D

MD

产前诊断方法,预防患儿出生,

是降低本病发病率的重要措施。v

通过Y染色体性别决定基因判断胎儿性别,运用聚合酶链反应检测4个Duchenne

型肌营养不良症家系中先证者dys

t

r

ophi

n

基因缺失热区内16个外显子是否缺失,并对胎儿进行相应外显子检测;

对家系成员和胎儿进行第45

、49、50内含子以及5’和3’端短片段串联重复序列的基因连锁分析能准确地对Duchenne型肌营养不良症进行产前基因诊断,且是目前最有效的实验室方法。P

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nt

.性别鉴定结果v

家系1

、2

和3

的胎儿Y染色体性别决定基因（SRY

）均为阳性,

为男性胎儿;

家系4

的胎儿S

RY为阴性,提示为女性胎儿,见图1。P

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nt

.缺失分析结果v

应用16

对引物对患者进行缺失分析,结果表明家系1

和家系2

的患者第45

和第47

外显子缺失;

对家系1

和家系2的男性胎儿进行45和47

外显子缺失分析,结果表明2

个男性胎儿均未缺失。P

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nt

.连锁分析结果v

采用5个短片段串联重复序列（S

TR）位点进行单体连锁分析,

家系3男性胎儿的

dys

t

r

ophi

n

基因S

TR位点基因型与先证者一致(

49CA

和3pCA

位点)

,

获得风险染色体。家系3的S

TR多态连锁分析（箭头所指为含有致病基因染色体的基因型）P

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.分子生物学在肿瘤中的应用v肿瘤的发生细胞水平——细胞增殖、分化、凋亡发生异常，细胞总数失控，恶性生长造成。基因水平——细胞周期（增殖、分化、凋亡）由两大类基因调控，原癌基因和抑癌基因。原癌基因

抑癌基因P

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wäww.

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.v肿瘤分为:癌,肉瘤,白血病/淋巴瘤v癌:90%的人类肿瘤,起源内胚层及外胚层上皮细胞v肉瘤,白血病/淋巴瘤v起源中胚层细胞,包括肌肉,骨骼,血管,成纤维细胞以及血液和淋巴系统中的循环细胞P

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.癌基因和抑癌基因（一）癌基因可在体外引起细胞转化、在体内引起癌瘤的一类基因称为癌基因。病毒中存在癌基因，统称病毒癌基因；各种动物细胞基因组中，普遍存在与病毒癌基因相似的序列统称为细胞癌基因；由于细胞癌基因在正常细胞中以非激活形式存在故又称为原癌基因。P

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.原癌基因的特点⑴广泛存在于生物界中,从酵母到人细胞普遍存在;⑵在进化过程中,基因系列呈高度保守性;⑶其作用通过其表达产物蛋白质来体现。它们的存在对正常细胞不仅无害,而且对维持正常生理功能/调控细胞生长和分化起重要作用，是细胞发育、组织再生、创伤愈合等所必需；⑷在某些因素作用（如射线、化学物质等)下,原癌基

因的结构和数量发生改变而被激活

→癌C转化基因P

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.癌基因激活与肿瘤的发生下面以几个常见的癌基因为例，阐述癌基因在细胞癌变和肿瘤发生发展中的作用。1、ras基因变异与肿瘤发生

早期人们用多种人类肿瘤中提取的DNA进行细胞转化，结果表明约10％～15％的肿瘤中至少有三种ras基因中的一种发生了点突变，其中K-ras基因更易成为突变的靶基因。目前对结肠和直肠肿瘤的发生发展与ras基因点突变间的关系已进行了较深入的研究。约50％的结、直肠癌有K-ras基因点突变。其中约80％的点突变位于K-ras第12个密码子，另有约15％发生在K-ras第13个密码子。通过对腺癌和腺瘤中ras基因的分析，有5％～10％直径小于lcm的腺瘤中有ras基因点突变。因此，ras基因点突变可能与腺瘤向癌的演变有关，并可能具有一定的临床意义。P

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.2．myc基因变异与肿瘤发生

myc基因是一种细胞癌基因，与之同源的病毒癌基因存在于一些具有高度致瘤性的猿逆转录病毒中。myc基因高水平表达时可转化啮齿类成纤维细胞。它在人类肿瘤中的活化方式首次在Burkitt淋巴瘤中发现，可通过染色体易位而活化，最常见的是通过8号染色体与14号染色体易位，使得8号染色体上的myc基因或其相邻区域与14号染色体的免疫球蛋白重链基因融合而被活化。尽管不同肿瘤中影响myc基因的易位断裂点的具体位置可能有所不同，但染色体易位的共同之处是改变了myc基因正常的表达调控机制。P

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.3．bc

l

-

2基因与肿瘤发生

bc

l

-

2基因是从B细胞淋巴瘤中鉴定出来的癌基因，通过染色体易位而激活，易位涉及14q的免疫球蛋白重链基因及染色体18q的部分序列。这一易位使得bcl

-

2基因序列与I

g位点的强调控元件相结合，导致易位细胞中bcl

-

2基因表达失控。bc

l

-

2基因编码蛋白分子量约25kD，位于核膜、部分内质网及线粒体外膜上，与抑制细胞程序化死亡相关。绝大多数结节非霍奇金淋巴瘤中均能见到易位活化的bcl

-

2基因表达。P

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.4．mdm2基因

mdm2基因是一种进化保守基因，基因表达产物是一个长度为491氨基酸的具有锌指结构的蛋白质。基因定位在染色体12q13-

14区域。蛋白定位在细胞核，半衰期很短。mdm2基因高表达时呈现癌基因的功能，尤其值得注意的是Mdm2蛋白可与p53和RB蛋白相结合而使其功能失活，这是Mdm2蛋白促进癌细胞生长的重要机制之一。多种因素可影响md

m2基因，如紫外线照射可诱导Mdm2蛋白的表达。P

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.v

有致癌能力的DNA病毒

:

(

6个病毒家族)v

乙肝病毒,猴病毒40,多瘤病毒,乳头瘤病毒,疱疹病毒,痘病毒v

只有一类RNA病毒致癌—反转录病毒v肿瘤抑癌基因的发现:

Hani

sv

1960年,正常细胞与肿瘤细胞融合—杂合体细胞不致瘤—正常细胞中具有肿瘤抑制基因—产生肿瘤表型的负调节物—当杂合体细胞某段染色体丢失后—细胞变为肿瘤表型---这段染色体上有重要的肿瘤抑制基因P

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.（二）抑癌基因抑癌基因是一类抑制C过度生长、增殖,从而遏制肿瘤形成的基因。对于正常C,

原癌基因和抑癌基因的协调表达

是调控C生长的重要分子机制之一。两者相互制约维持相对稳定。原癌基因激活或过量表达

(

或抑癌基因的丢失或失活)

，均可导致肿瘤的发生。P

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.抑癌基因失活与肿瘤发生在此仅以研究得较为清楚的几个抑癌基因为例，说明抑癌基

因

失

活

与

肿

瘤

发

生

的

关

系

。p16基因又称为多肿瘤抑制基因（multiple

tumorsuppressor

l，MTSl）。p16基因全长8.5kb，由二个内含子和三个外显子组成，编码细胞周期依赖性激酶CDK4的抑制蛋白，该蛋白的分子量为15.8kD，故称为p16。p16蛋白既是细胞周期的有效调控者，又是抑制肿瘤细胞生长的关键因子，p16蛋白与细胞周期素D（cyclinD）竞争与CDK4结合，当p16与CDK4结合后，能特异地抑制CDK4的活性。视网膜母细胞瘤RB蛋白在控制真核细胞周期中起重要作用，低磷酸化或非磷酸化的RB可阻止细胞由G1进入S期，而CDK4可使RB磷酸化，CDK4受抑制，则不能解除RB蛋白对转录因子的抑制，从而抑制细胞增殖，阻止细胞生长。当cyclinD与CDK4结合时，刺激细胞生长分裂。正常情况下，cyclinD和p16对CDK4的作用处于平衡状态。当p16基因异常而不能正常表达，cyclinD则与CDK4以优势结合，使细胞生长失去控制，细胞表型产生变化。P

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.p16基因异常主要以基因缺失为主，且多为纯合性缺失，在肿瘤细胞系中可达80％以上，在实体瘤中可达70％左右。点突变发生频率较低，不同肿瘤的突变频率不同。同一肿瘤的不同分化程度的细胞中，p16基因缺失和突变率也不同。细胞株的基因异常高于实体瘤，基因异常总发生率高于其它已知的抑癌基因。p16基因异常的肿瘤包括了人类肿瘤的大部分类型，也包括散发性和具遗传倾向性的肿瘤。P

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.v抑癌基因:vP53—多种肿瘤.早期发现肿瘤中P53表达增加,认为是癌基因.正常P53基因抑制肿瘤形成,肿瘤中过量表达的是P53基因突变体—作为显性抑制物影响P53功能—致癌v

P16,PTP多种抑癌基因vWT1—肾母细胞癌vDCC—结肠癌vAPC—家族性腺瘤息肉癌变v

广义的讲,许多在细胞繁殖中起正常作用的基因,如DNA修复基因，其突变也会导致肿瘤的发生,它们的存在间接地起到抑制肿瘤的作用P

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.肿瘤发生中的多基因协同作用从以上所述癌基因与抑癌基因的作用来看，似乎体内任一癌基因激活或抑癌基因失活，都会导致肿瘤的发生。其实问题远非如此简单。在单一的肿瘤组织中，往往同时存在多种遗传缺陷，包括原癌基因的易位、扩增、点突变和抑癌基因的缺失等。另一方面，原代培养的动物细胞需要有两个以上癌基因同时活化才能转化成癌细胞。许多实验证明，与肿瘤发生、发展密切相关的基因如细胞周期调控基因、凋亡相关基因、血管生长因子和受体的基因、端粒酶等，确实存在着协同作用。P

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.因此，目前普遍接受的是细胞癌变的多基因协同假说。该假说认为细胞癌变是多步骤、多重打击的复杂过程，在肿瘤发生发展的各阶段，至少需要两个或更多个不同的癌相关基因的异常激活或失活，才有可能引起细胞的癌变。这可能因为细胞的增殖受多种因素的控制，需要有多种癌相关基因的协同作用才能脱离这些控制。P

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.v凋亡抑制基因Ｓｕｒｖｉｖｉｎ

在甲状腺癌组织中的表达及意义v

刘钢

史火喜

袁又能

黄文广v【摘要】

目的

探讨凋亡抑制基因Ｓｕｒｖｉｖｉｎ

在甲状腺癌中的表达及其与病理预后之间的关系。方法

应用免疫组化法检测６８

例甲状腺癌、５４

例甲状腺腺瘤、３２

例癌旁组织和２３

例正常甲状腺组织中Ｓｕｒｖｉｖｉｎ

的表达情况，评价Ｓｕｒｖｉｖｉｎ

的阳性表达率与甲状腺癌的病理预后之间的关系。结果

Ｓｕｒｖｉｖｉｎ

在甲状腺腺癌组织、甲状腺腺瘤组织、癌旁甲状腺组织及正常甲状腺组织中的阳性表达率分别为４４％、２５％、１８％和０。甲状腺未分化癌和髓样癌组织中Ｓｕｒｖｉｖｉｎ

的阳性率明显增高，存在转移和临床Ⅲ、Ⅳ期病例中，Ｓｕｒｖｉｖｉｎ

的阳性率明显增高。结论

Ｓｕｒｖｉｖｉｎ

过量表达可能与甲状腺肿瘤的发生发展有关，癌组织中Ｓｕｒｖｉｖｉｎ

的表达可作为判断甲状腺癌病理类型和预后的参考指标。P

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.肝癌的分子生物学诊断与基因治疗v

正常肝细胞转化为肝癌细胞是一个复杂的过程,大部分要经历病毒感染(HBV等)

、肝炎、肝硬化、肝癌.在临床上表现为良性肝病变、早期癌、进展期癌几个阶段。同时也与其他肿瘤一样是一个多基因参与的多步骤的复杂过程。以往的只能通过一个或几个基因的变化寻找肝癌特异基因,因此很难准确发现并揭示基因改变在肝癌发生、发展过程中的作用机制.v

既往的研究表明大量的癌基因、抑癌基因、DNA修复基因和细胞周期调控基因参与肝癌的形成。v

目前发现的癌基因已达200余个,包括myc

,src,neu,fos,jun,abl

,sis和ras

等家族。v

病毒感染量对于HBV相关的HCC是一个重要的预后指标。血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶9

(MMP-9)能够降解基底膜糖蛋白及细胞外基质成分P

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.肝癌的分子生物学诊断与基因治疗v

利用基因芯片(cDNA

clone

23

075)

对1021

例HCC及10

株HCC细胞系进行研究。结果发现大量与HCC

增殖分化,浸润转移相关的基因簇。同时发现HBV、HCV阳性和阴性的HCC基因表达类型不同。v

利用基因芯片研究了HCC基因表达谱,发现骨桥蛋白基因,在HCC转移灶中表达与原发瘤中的表达一致,相反,转移性HCC与没有转移的HCC之间基因表达差异显著。骨桥蛋白可能成为转移性肝细胞癌的一个潜在治疗靶点。v

问题:

(1)

选择真正能反映肝癌生物学行为的目的基因;

(2)基因诊断的结果如何与传统诊治方法相结合;

(3)

基因治疗中引入人体内的外源基因如何达到长期稳定及有效的调控,如何来确定;

(4)

理想、高效、安全、和特异性好的基因治疗载体的开发;

(5)

基因诊断和治疗的伦理学问题P

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.v

在心血管疾病中，已发现高脂蛋白血症、原发性高血压、动脉粥样硬化、心肌肥厚、肥厚性心肌病等疾病的发生与基因的变异相关。以下以原发性高血压为例来说明基因变异和心血管疾病的关系。v

血管紧张素转换酶（angiotensin-converting

enzyme，ACE）基因

;人的肾素基因定;血管紧张素原的基因

;心钠素基因家族主要有心钠素基因（ANP）、脑钠素基因（BNP）和C型利钠激素基因（CNP）三个主要成员

;内皮素家族主要有内皮素（ET-1、ET-2、ET-3）三个主要成员

;一氧化氮合成酶和激肽释放酶的基因;信息传递体β2-肾上腺素能受体基因

,

G蛋白鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（GNBP

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.v多种神经系统疾病的发生与基因的变异有关，如精神分裂症、帕金森氏综合征、老年性痴呆等。以下以老年性痴呆为例来说明。v淀粉样前体蛋白（APP）基因;早老素基因（presenilingene，PS基因）

APP基因的突变所致AD仅占FAD的2％~3％。而PS基因的突变则为大多数FAD的病因;载脂蛋白E（ApoE）基因,1993年Strittmatter等发现ApoE的等位基因ε4与晚发AD相关联;P

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.分子生物学技术在感染性疾病中的应用举例引起人类感染性疾病的病毒很多，均可造成相应的病毒血症，并侵入特定的脏器，用分子生物学技术诊断血中和受累脏器中感染的病毒具有十分重要的意义。P

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.乙型肝炎病毒感染v乙型肝炎病毒（HB

V）：属嗜肝DNA病毒科(

he

pa

dna

vi

r

i

dae)

，基因组长约3.2kb

，为部分双链环状DNA。P

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.HB

V感染的诊断主要采用免疫学检测法，但测定的是病毒的蛋白和机体产生的相应抗体，分子生物学技术可直接检测病毒的核酸，敏感性更高（P

CR可检出HB

V

DNA2

0

-

60拷贝/

ml

），不仅可检出感染的窗口期和病毒浓度极低的临床标本，还能根据定量P

CR的结果对治疗、预后和传染性进行评估，监测和考核抗病毒疗法，通过对P

CR扩增产物的检测和测序，可进行基因分型和检测有关基因区的突变和耐药突变；而原位杂交和原位PCR可研究HB

V的复制状态和与原发性肝癌的关系等。P

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.HBV治疗前：a:

治疗前HBV低水平复制者对干扰素的反应性明显优于高水平复制者。b:

治疗前HBV

DNA含量特别高者大多没有疗效。c:

HBsAg转阴的几