第三章蛋白质5周五

上节内容蛋白质的结构与几种蛋白质的结构与转运蛋转运蛋收缩与免疫球蛋白质两性胶沉两性胶沉变性与折紫外本章主要内二．氨基重点)四．蛋白质的结构（重点五．蛋白质结构与功能（重点六．蛋白质的性质（重点七．蛋白质的分离纯化与鉴定（重点七、Protein1.Salting盐析（saltingout）原理：破坏蛋白质疏水区表面的水化层导致蛋白质沉淀。最先的是那些表面Differentproteinsprecipitatedatdifferentsaltconcentrations(饱和或半饱和浓度).Itisoneofthemostcommonlyusedforprotein盐溶（Saltingin）稀盐浓度范围内，增加蛋白质SaltingAmmoniumsulfate,(NH4)2SO4,isthemostcommonlyusedreagentforsaltingoutThepHmaybeadjustedtoapproximatethepIofthedesiredprotein.Asignificantconcentration（浓缩）oflargetiesofproteinSalting分分级增加盐浓度，控制pH,沉淀目标蛋白（白色）Ionexchange原理：电荷差异，参看aminoAnion阴离子DEAE:Cation阳离子exchangersCM:carboxymethylMatrixcelluloseandagarose-basedresins树脂IonexchangeIsoelectric等电聚焦（IEF）原理：电荷不可用于蛋白质等电点的测定，分辨率（pI<GelfiltrationMolecularsieve分子筛MolecularareseparatedaccordingtotheirsizeandshapeStationaryphase固定相gelbeadscontainingporesthatspanarelativelynarrowsizerangeSephadex（葡聚糖凝胶Bio-gelP（聚丙烯酰胺凝胶Gelfiltration七、ProteinSDSsodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠PAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis非常有纯度检测；亚基组成分析；分子量测1.4gSDS/1g两个氨基酸结合一个 结果所有肽链覆盖上相同密度的负电荷可看成若存在链间二硫键，如何进行分SDS装置及电泳SDS测定蛋白质的Two-dimensionalPermitstheresolutionofcomplexmixturesofproteinsAmoresensitive yticalmethodthaneitherelectrophoreticmethodalone.SeparatesproteinsofidenticalmolecularweightthatdifferinpI,orproteinswithsimilarpIvaluesbutdifferentmolecularTwo-dimensional②①>60000应用：最常用方法：(densitygradient常用的密度梯度：DensityGradient（密度梯度离心Dialysisand半透膜：玻璃纸、火棉纸、改性纤维素将蛋白质与其他小分子物浓缩和脱粗分Ultrafiltration(超过滤Affinity（亲和色谱Principle:Manyproteinscanbindspecificmolecules(ligand)tightly.Ligandiscovalentlyattachedtoaninertmatrix.Asignificantpurificationchromatography(免疫亲和色谱)ligand=antibodyHis-tag（组氨 其他用途增加蛋白可溶性提高蛋白稳定性浆状动(植)机械破浆状动(植)

低速离蛋白(除膜等杂蛋白蛋白蛋白

蛋蛋白层析电泳检蛋白蛋白

纯纯稀透（除盐

电泳检

－80℃蛋白质含量双缩Folin－酚试剂法（Lowry法Bradford法（考马斯亮 蛋白质纯度HP