《生物实验技术》第三章 染色、染料与染色剂

第三章染色、染料与染色剂染色染色（dying,staining)：将染料配成溶液，将组织浸入其中，使组织或细胞的某一部分染上与其它部分不同的颜色或不同深度的颜色，产生不同的折射率，使组织或细胞内各部分的构造显示得更清楚，便于光镜观察。

第三章染色、染料与染色剂第一节染料的一般性质

一、染料的结构和定义1.结构有机化合物有色物质染料有颜色

与被染组织间有亲和力发色团：助色团：分子结构显色团或色原，使化合物产生颜色的含有不饱和键的基团。使染料变成电解质，成为带正负电荷的离子，从而与组织产生亲和力。常见发色团：常见助色团：第一节染料的一般性质

第三章Backto2常见的助色团：羟基-

OH，羧基-COOH，氨基-NH2，磺酸基-SO3H，甲胺基-NH·CH3，二甲胺基-N（CH3）2

，卤素Cl-、Br-、I-等常见的发色团有：硝基－NO2，亚硝基－NO，偶氮基（－Ｎ＝Ｎ－），印胺基（－Ｎ＝），对醌基（==），乙烯基（C=C）等口第一节染料的一般性质

第三章举例:苯无色液体-3NO2NO2NO2NO2三硝基苯黄色固体-OHOHNO2NO2NO2三硝基苯酚有色物质黄色固体染料第一节染料的一般性质

第三章2.染料的定义染料是一种有机化合物，在它的结构式苯环上有两种基团，一种为发色团，颜色由它产生；另一种为助色团，可促使化合物电离，使染料成为盐类，从而产生染色性。

第一节染料的一般性质

第三章二、染料的分类（1）据来源分类（2）按染料的性质分类（3）据染色对象（应用）分类天然染料合成染料(煤焦油染料，苯胺染料或亚尼林染料)P24酸性染料：主要有色部分为阴离子

碱性染料：主要有色部分为阳离子

中性染料：有色部分阳离子和阴离子都有组织染色染料：如结缔组织等细胞染料：细胞核染料、细胞质染料细胞化学成分染料：如脂肪染料等GotoNo9第一节染料的一般性质

第三章嗜碱性：细胞和组织的酸性物质或结构（嗜碱性物质）与碱性染料(如苏木精）亲合力强，称嗜碱性。嗜酸性：碱性物质或结构（嗜酸性物质）与酸性染料（如曙红）亲合力强，称嗜酸性。中性：与两种染料的亲合力均不强的。酸性染料与碱性染料，不是指染料本身的酸碱性(pH)

如：曙红为酸性染料，其溶液呈碱性反应；结晶紫是碱性染料，其溶液呈酸性反应

区分概念：组织第一节染料的一般性质

第三章苏木精碱性染料曙红酸性染料嗜中性嗜酸性嗜碱性第二节染色理论

第三章染料被染组织溶剂媒染剂染色理论化学学说物理学说综合作用染色染色机制不很清楚第二节染色理论

第三章一、物理学说（1）毛细现象（毛细管作用）

（2）吸收作用（absorption）（溶液学说）

（3）吸附作用（adsorption）

（4）沉淀作用

组织有许多微孔，可借助毛细管作用与染料接触。组织吸收染料作牢固的结合，染料均匀地分布于组织中，叫吸收。组织的着色与溶液的颜色相同。如：品红吸附作用是固体物质的特性，它能从周围溶液中吸住一些细小的物质微粒，吸附作用只发生在两相界面上。可解释鉴别染色借扩散与吸收作用进入组织的染料，一部分被组织内的酸碱所沉淀，不能用单纯的溶剂将其分离。第二节染色理论

第三章二、化学学说染料细胞成分（阴）酸性染料（阳）碱性染料（阴、阳）中性染料酸性物质（如核酸）碱性物质（如细胞质）两性基团（如蛋白质）血红细胞染上酸性染料还是碱性染料与染液酸碱性有关。细胞各组成部分染色的强弱，与细胞的组成（酸、碱性）及染料的性质（酸性、碱性、中性）有更密切的关系。两者亲和力强，染色就深。第二节染色理论

第三章二、化学学说

蛋白质（两性基团）在酸性溶液中：呈盐基性，带正电荷，与带负电荷的离子化合在碱性溶液中：呈酸性，带负电荷，与带正电荷的离子化合等电点（PI）：当在某一pH时，分子的正负离子等量，分子所带电荷呈中性，此时的pH即是该蛋白质的等电点。RCCOO-NH3+第二节染色理论

第三章二、化学学说染液pH>组织PI染碱性染料PI时染液pH<组织PI-Pr+OH--Pr+-Pr+H+染酸性染料分子状态呈中性染液pH>组织PI：组织较偏酸性，染碱性染料染液pH<组织PI：组织较偏碱性，染酸性染料第三节染色剂的配方与应用

第三章一、细胞核染料与配方细胞核主要成分是核酸和蛋白质，细胞核染料多属碱性染料1.苏木精（苏木色素，Hematoxylin）C16H14O6

淡黄色或褐黄色。必须氧化成氧化苏木精（深红色）。氧化过程也叫成熟过程。COHHOOCH2CHOHCH2OHOH氧化对鲲基COHHOO

CH2COHCH2OOH性质：第三节染色剂的配方与应用

第三章一、细胞核染料与配方

苏木精自然氧化需要时间长。急用时，可加入氧化汞、高锰酸钾、过氧化氢、碘酸钠等强氧化剂加速氧化，随配随用。

苏木精易溶于酒精，微溶于水及甘油。

氧化苏木精与组织的亲和力较弱，常与媒染剂铁明矾、钾明矾、铵明矾等混合使用。机理：苏木精的色素根+媒染剂沉淀色素（带正电荷），其作用如同碱性染料，增强了亲和力。第三节染色剂的配方与应用

第三章一、细胞核染料与配方1.爱氏（Ehrlich）酸性苏木精苏木精2g95%Alc100ml

蒸馏水100ml

甘油100ml

钾明矾3g

冰醋酸10ml2.海登汉氏（Heidenhain）苏木精甲液：铁明矾2.5g

蒸馏水100mL

乙液：苏木精0.5g95%Alc10ml

蒸馏水100ml配方：冰醋酸：使染色稳定，不易褪色，同时防止苏木精因存放过久而沉淀甘油：避免染液蒸发、过染，使染色均匀（用前配制）（氧化成熟）甲、乙液用前混合，有效期为24h第三节染色剂的配方与应用

第三章一、细胞核染料与配方爱氏酸性苏木精可配成储备液，而海登汉氏苏木精则需要在使用前混合？？

钾明矾的铝离子+苏木精色素根蓝色沉淀

(溶于水)，但与组织结合后则难以用水或酒精溶去。铁明矾+苏木精色素根黑色或深兰色沉淀（不溶于水）第三节染色剂的配方与应用

第三章一、细胞核染料与配方2.胭脂红（洋红、卡红）Carmine

优良的细胞核染料，对粘液和肝糖的染色也有良好效果。用于切片或组织块染色，特别适宜于小型材料的整体染色。性质：

单纯的洋红不能染色，它与组织无直接的亲和力。

等电点pH4.07~4.5。需要用低于或高于它的等电点的溶液溶解。酸性溶液常用冰醋酸或苦味酸，碱性溶液用氨、镁、锂、硼砂等。第三节染色剂的配方与应用

第三章一、细胞核染料与配方1.硼砂洋红（Grenacher's）（葛莱那息尔氏）洋红2g4%硼砂水溶液100ml70%酒精100ml2.醋酸洋红液（Schneider's）（施尼得氏）洋红4~5g

冰醋酸

45ml

蒸馏水55ml例：

切片（染5－10min）一般动植物（如原生动物，腔肠动物，扁型动物等）的整体染色昆虫、寄生虫染色

适合于新鲜细胞学材料快速观察，速染新鲜细胞的染色体。如：无脊椎动物的精巢、卵细胞、上皮组织等的中心体和染色体；植物的根尖细胞及花药等图示洋红染色日本小帘蛤肠道内涡虫醋酸洋红染阔叶葱花粉囊分裂细胞洋红染轮虫第三节染色剂的配方与应用

第三章一、细胞核染料与配方3.番红Ｏ或沙黄Ｏ（SafraninＯ）

细胞学及动植物组织学常用染料所染组织：细胞核及染色体，维管束植物的木质化、木栓化及角质化的组织，植物蛋白质，孢子囊等。番红Ｏ的染色以Flemming氏液固定的为佳。常与快绿、亮绿作对比染色。番红O-快绿染骨切片第三节染色剂的配方与应用

一、细胞核染料与配方第三章4.地衣红（补充）从茶渍地衣中提取的一种弱酸，碱性溶液中呈紫色，酸性溶液中呈橙红色。染植物细胞的染色体效果比醋酸洋红好，常用2.2%醋酸地衣红液地衣红酒精溶液可用于动物弹性纤维染色。5.碱性复红（碱性品红）Basicfuchsin第三节染色剂的配方与应用

一、细胞核染料与配方第三章

暗绿色粉末或结晶，水溶液呈红色。较强的核染色剂，在生物学染色中用途很广。可染：粘朊、弹性组织、嗜复红性颗粒；维管束植物的木质化壁；原球藻、轮藻的优良染色剂；细菌学中结核杆菌的鉴别染色；中枢神经组织的核染色剂；组织化学试剂Schiff试剂的主要成分，显示DNA（Feulgen反应）和多糖类（PAS反应）。缺点是容易褪色。第三节染色剂的配方与应用

一、细胞核染料与配方第三章6.甲基绿（甲烷绿、甲绿）Methylgreen7.美兰（亚甲兰、次甲基兰、甲烯兰）常用以染染色体。与吡罗红Pyronin（又叫派若宁、焦宁）合用显示DNA、RNA。

染神经组织、肥大细胞、嗜碱性颗粒、浆细胞、尼氏体、粘液、血液等无锌美兰对活体无毒，可做神经组织活体染色。生物学、病理学、细菌学常用的胞核染料优点：不易过染8.中性红Neutralred（补充）9.结晶紫（Crystalviolet)，又叫龙胆紫第三节染色剂的配方与应用

一、细胞核染料与配方第三章

红色粉末，弱的核染色剂，呈弱碱性。无毒，活体染色剂，常用1%水溶液。活体染色时可用相应的等渗液配制。如：染原生动物或动植物组织中活细胞内含物

核的重要染料，广泛应用于细胞学及细菌学细胞分裂的优良染色剂，能显示染色体、中心体、类淀粉、纤维蛋白和神经胶质等，与番红用作染色体的双重染色，可将染色体染成红色，纺锤丝染成紫色。中性红染肺癌细胞第三节染色剂的配方与应用

二、细胞质染料第三章1.曙红（伊红）

Eosin

常用曙红Y，四溴荧光素，带黄绿色荧光苏木精的最好对比染色剂，优良的细胞质染料染细胞质、胶原纤维、肌肉纤维、神经纤维、嗜酸性颗粒及酶原颗粒等，也是血液染色剂中的重要成分

酸性染料第三节染色剂的配方与应用

二、细胞质染料第三章2.桔黄G（金橙G、橙黄G）OrangeG

强酸性染料苏木精的对比染色，特别是铁苏木精的对比染色

Mallory三色染色剂中的重要成分3.苦味酸

与酸性复红作对比染色染结缔组织。4.水溶性苯胺兰（棉兰）AnilinblueW.S.Mallory氏三色染色剂的重要成分铁苏木精的对比染色组织学和病理学中经常使用，染细胞质、神经鞘。第三节染色剂的配方与应用

二、细胞质染料第三章5.耐绿—FCF（快绿、固绿）FastgreenFCF

性质与亮绿相似，但染色力较亮绿强，不易褪色。常用于植物染色，作番红O、苏木精及Feulgen反应的对比染色。6.亮绿（光绿、浅绿）LightgreenSF

性质同耐绿，易褪色。7.藻红Erythrosin

与曙红相似，主要用作苏木精的对比染色，细胞质较好的染色剂，也是真菌的染色剂。

第三节染色剂的配方与应用

二、细胞质染料第三章8.酸性复红（酸性品红）Acidfuchsin

碱性复红的一个磺化衍生物细胞质染色剂，但也可染细胞核及线粒体

VanGiesen氏及Mallory氏结缔组织染色剂与苦味酸染色鉴别平滑肌和结缔组织。在植物制片中染皮层、髓部及纤维质壁。第三章第三节染色剂的配方与应用

三、脂肪染料特点：油溶性，不溶于水，使用时用醇配制。染色时间不能过久，否则酒精会把组织内脂肪溶解。第三章第三节染色剂的配方与应用

三、脂肪染料1.苏丹Ⅲ（SudanⅢ）用95％或70％酒精配成饱和液使用。将动、植物脂肪组织染成红色。植物方面可作角质化、栓质化的鉴别染色。

2.苏丹Ⅳ较强的脂肪染色剂，目前代替苏丹Ⅲ染脂肪。用丙酮与70％酒精的等混液溶解。脂肪染成红色第三章第三节染色剂的配方与应用

三、脂肪染料3.油溶红—O较强的脂肪染料，用法与苏丹Ⅳ相同

4.苏丹黑Ｂ

主要染细菌的脂肪，染成黑色。

标准苏丹黑B法和溴苏丹黑B法可作为有无脂类的扫描实验。Baker’s甲醛钙固定液固定。四、活体染料第三章第三节染色剂的配方与应用

用来作活体染色的染料，无毒或毒性很小。如：中性红、詹纳氏绿、台盼兰（曲利本蓝、锥兰）、硫酸尼罗兰、无锌美兰、结晶紫、俾氏麦棕等，甲基紫、茜素红可用于原生动物活体染色。五、荧光染料第三章第三节染色剂的配方与应用

荧光：有些物质当用紫外光照射时，吸收了某种波长的紫外光后发射出各种颜色和不同强度的可见光，当紫外光停止照射后，这种光线也随之消失，将这种光线称为荧光（一般持续10-7~10-8S）。荧光色素：可以产生明亮荧光的染料物质。如：异硫氰酸荧光素（FITC）、四乙基罗达明（RB200)、溴化乙啶（EB)等六、特殊试剂第三章第三节染色剂的配方与应用

本身无色，但与切片作用后可显色。金属浸镀剂：硝酸银、氯化金、四氧化锇等。组织化学试剂：氧化剂有过碘酸、过氯酸、过氧化氢等。还原剂有偏重亚硫酸钠、偏重亚硫酸钾等。另外还有β－甘油磷酸钠、巴比妥钠、联苯胺等。氯化金染色，显示运动终板第三章第四节染色方法

整体染色法如：原生动物、单胞藻、生物小型器官等。2.组织块染色法将组织块固定、水洗后，用稀染液染色，再包埋切片。3.蜡带染色法用于如水解酶等易被破坏物质的染色。4.切片染色法：制片时常用染色方法。5.特殊染色法4.切片染色法：（1）因染色步骤，即染色剂对材料的反应不同分为：①单一染色法：如铁苏木精染细胞有丝分裂制片②复染色法（对比染色法）：如H-E染色③多重染色法：如Mallory三色染色法染结缔组织。

微生物的染色：单染色法：形态观察复染色法：革兰氏染色法（可鉴别染色）第三章第四节染色方法

铁苏木精染色马蛔虫卵Mallory三色染色法H-E染色革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌（2）据染色时所用染料浓稀程度不同分为：渐进法：稀染色液中，由浅而深渐渐着色。如：整体染色法后退法：较浓的染液中，先行浓染色后再褪色。如：切片的染色（3）据染色时是否使用媒染剂分为：直接法：不需经过媒染剂的作用。如：一般的合成染料

间接法：必须经过媒染剂的作用。如：苏木精第三章第四节染色方法

5.特殊染色法：（1）活体染色法：活体内染色活组织的染色（2）金属沉淀法：也称金属浸润法或金属浸镀法

常用于组织块；纤毛虫等（3）荧光染色法：灵敏度高，特异性强。

荧光染液浓度一般10-4-10-5，普通染色剂的浓度一般为10-2

。第三章第四节染色方法

将无毒或毒性很小的活体染料的稀染液注入动植物体内或加入培养基（液)中，使其被细胞吸收而染色。用可溶性重金属盐的稀溶液处理细胞组织，再用有机酸类如甲酸、醋酸、草酸等进行还原，使金属盐形成不溶性的黑褐色金属或金属氯化物，沉积于结构的表面，形成黑褐色的影像，显示其结构。亲银性：银染法中有些组织结构可直接使硝酸银还原而显示，称为~。嗜银性：有些结构无直接还原作用，需加入还原剂方能显色，称为~。银染色方法：硝酸银溶液直接染色(或+还原剂)

第三章镀银染色，显示大脑皮质神经元第四节染色方法

网状纤维具有嗜银性，可以用银盐染色来显示。第三章第四节染色方法

图示：不同的染色方法的不同效果第三章第四节染色方法

H&E染色的中等动静脉醛复