桂西生姜总黄酮的提取及对羟自由基的清除作用研究

桂西生姜总黄酮的提取及对羟自由基的清除作用研究【摘要】目的探讨桂西生姜总黄酮的提取、鉴别及对羟自由基清除作用，以充分利用桂西生姜植物资源，避免资源的浪费。方法采用超声波乙醇浸提法从桂西生姜中提取黄酮类物质，对所提取的黄酮类物质进行验证，并用分光光度法测定含量，用桂西生姜总黄酮对羟自由基清除作用进行实验。结果测得样品中总黄酮的含量C=mg/ml，回收率为%，其纯度和产率均较高。结论该方法采用全物理过程，无任何污染，是提取桂西生姜黄酮类物质的有效途径。桂西生姜总黄酮提取液对Fenton体系产生的·OH自由基有很好的清除作用。

【关键词】超声波提取生姜总黄酮鉴别自由基清除

Abstract：ObjectiveTomakeuseoftheresourcesofGuixi‘sZingiberofficinaleRoecoe,avoidwastingandapproachtheextractionoftotalflavanoneofGuixi‘sZingiberofficinaleRoecoeandtostudyitseffectsonscavengingofhydroxylflavonoidswereextractedbyethanolasthesolventfromGuixi‘szingiberofficinaleroecoewithultrasonicwaveandethanolspectrophotometrytoextractandchecktheflavanoneofGuixi‘sZingiberofficinaleRoecoe．TheeffectofextractsonGuixi‘sZingiberofficinaleRoecoescavengingofhydroxylradicalswasstudied．ResultsBythismethodthedensityofthetotalflavanoneofGuixi‘sZingiberofficinaleRoecoewasC=mg/mlandtherateofrecoverywas%.ConclusionTheoutcomeandthepurityoftheflavanonebytheextractionandpurifyingmethodsareallveryhigh.Themethodsarepurelyphysicalprocessesandhavenotanypollution.ItisanidealwaytoextracttheflavanoneofGuixi‘sZingiberofficinaleRoecoe.TotalflavanonefromGuixi‘sZingiberofficinaleRoecoehaveeffectsonscavengingofhydroxylradicals.

Keywords：Ultrasonicwavetreatment；ZingiberofficinaleRoecoe；Totalflavanone；Identification；Hydroxylradical；Scavenging

生姜是姜科植物姜ZingiberofficinaleRoecoe的新鲜根茎，又名地辛、百辣云，系姜科多年生宿根草本植物的根茎，是一种被广泛应用的药食两用植物，既是调味佳品，可以去鱼肉腥味，也是工业上提取香精的重要原料，更是宝贵的中药材(生姜、鲜姜汁、生姜皮，以及加工炮制后煨姜、炮姜、姜炭等都是治病常用的药)，能够抵御百邪［1］。原产于太平洋群岛，我国中部、东南部至西南部广为栽培，资源丰富［2］。生姜性辛热，具有温中逐寒、回阳通脉的功效［3］。其有辣味香气，有刺激味，能增强食欲，兴奋胃肠平滑肌和呼吸中枢，有促进消化液分泌的作用［3］。其主要成分为姜烯、姜醇、没药烯、一姜黄烯、甲基庚烯酮等［3］。早期的药理实验证明，生姜具有发表、散寒、止呕、开痰之功效，用于治疗伤风感冒、咳嗽多痰、胃寒呕吐等症［3］。现代科学证实，生姜具有抗衰老、抗肿瘤、降血脂、促进血液循环、调解中枢神经、消炎抗菌等作用［3］。

目前国内外对生姜的黄酮类物质的研究还相当的缺乏。黄酮类有效成分对治疗冠心病、老年性痴呆、脑血栓、神经系统疾病和消除自由基、抑菌、抗癌等方面有显着效果，无副作用，并以此开发出多种药品和保健食品［4］。笔者曾用乙醇提取法提取桂西生姜总黄酮，但提取效率仍较低。近年来，超声技术应用于提取植物中的生物碱、苷类、生物活性物质、动物组织浆的毒质等研究已有报道［5，6］，表明其具有能耗低、效率高、不破坏有效成分的特点。很多研究表明，利用超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，可加速植物材料中的有效成分进入溶剂，从而增加有效成分的提取率，缩短提取时间，并且还可避免高温对提取成分的影响［6］，但超声技术应用于提取桂西生姜中黄酮类物质的研究尚未见报道。为此，本文报道用超声波乙醇浸提法提取桂西生姜总黄酮、鉴别及提取物总黄酮对羟自由基的清除作用。现报道如下。

1仪器与试剂1仪器

KQ5200DB型数控超声波清洗器；UV-755B紫外可见分光光度计；ZF-I型三用紫外分析仪(上海顾村光电仪器厂)；SHB-III循环水式多用真空泵。2试剂

95%乙醇AR；亚硝酸钠AR；硝酸铝AR；氢氧化钠AR；三氯化铝AR；盐酸AR；氨水AR；冰醋酸AR；醋酸乙酯AR；乙酸镁AR；甲醇AR；镁粉AR；正丁醇AR；芦丁标准品；新鲜桂西生姜采自广西百色市。

2方法与结果

总黄酮成分提取取新鲜桂西生姜，烘干，粉碎。称取桂西生姜粉末6g，加80ml95%乙醇，超声波提取h，抽滤。滤渣再加80ml95%乙醇，超声波提取h，抽滤，合并两次滤液，减压回收乙醇至滤液仅剩5～7ml左右为止，放置100ml容量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，得样品液。

测定方法

依据以芦丁为对照品测定桂西生姜中总黄酮的含量，加入铝离子试剂，同时控制适宜pH值，使黄酮化合物与铝盐形成络合物，在可见光区能获得稳定的特征吸收峰。

定量实验-总黄酮的含量测定

波长的选择

取样品液适量，在ml5%亚硝酸钠溶液存在的碱性条件下，经硝酸铝显色后，以试剂为空白参比液在420～700nm波长范围测定络合物的吸光度，络合物于510nm波长处有最大吸收，故测定时选用此波长。

标准曲线的绘制

分别精密吸取芦丁对照液，，，，，，ml于ml容量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠溶液ml，摇匀，静置6min；再加10%硝酸铝溶液ml，摇匀，静置6min；再加4%氢氧化钠溶液ml，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置12min，以试剂作空白参比液，于510nm处测吸光度。结果见表1。表1紫外可见分光光度计测定芦丁对照液吸光度结果

根据上表得回归方程：A=-+，r=。

提取物含量的测定精密吸取样品液ml，置10ml容量瓶，按标准曲线的制备方法测定吸光度A=，根据回归方程：A=-1+4C，计算样品中总黄酮的含量C=3mg/ml。

回收率实验精密量取样品液ml，加入标准芦丁对照品ml，同前样品测定方法操作测定吸光度，求出回收率为%。

定性实验-总黄酮的鉴别

颜色反应

紫外光下呈色反应：取该样品溶液点在滤纸上，在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈灰褐色并有荧光斑点。浓氨水反应：取该样品溶液点在滤纸上，将滤纸在氨水上方熏min，立即在紫外光下观察，呈极明显的黄褐色荧光斑点。

三氯化铝反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加１％三氯化铝乙醇溶液，吹干。在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈黄色荧光斑点。

乙酸镁反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加1%乙酸镁甲醇溶液，吹干，紫外光下呈黄色斑点。

盐酸-镁粉反应：取乙醇提取液1ml于试管中加镁粉，再加入浓盐酸数滴，在泡沫处呈紫红色。

纸层析

取样品溶液10μl点在滤纸上。用正丁醇∶醋酸∶水=4∶1∶5为展开剂，上行展开5h，取出晾干。喷1%氯化铝乙醇溶液。吹干后于紫外光下，可见荧光斑点。

总黄酮提取物对·OH的清除作用参照Fenton反应的方法建立反应体系模型［7］，利用H202与Fe2+混合产生·OH，但由于·OH具有很高的反应活性，存活时间短，若在反应体系中加入水杨酸，就能有效地捕捉·OH，并产生有色产物。反应式H202+Fe2+→Fe3++·OH+OH-该产物在510nm处有强吸收，若在此反应体系中加入具有清除·OH功能的被测物，便会与水杨酸竞争·OH，从而使有色产物生成量减少，采用固定反应时间法，在相同体积的反应体系(mmol/LH2O21ml，9mmol/LFe2+lml，9mmol/L1ml水杨酸-乙醇溶液)加入一系列不同浓度的桂西生姜总黄酮提取液，并以蒸馏水为参比，与试剂空白液比较，在510nm处测量各浓度下的吸光度，便能测定被测物(总黄酮)对·OH的清除作用，其清除率计算公式

清除率(％)=A0-AχA0×100%

以实验的提取液总黄酮作为样品，分别取不同体积的样品定容到50ml分别测其对·OH的清除作用。从图1中可看出，桂西生姜总黄酮提取液对由Fenton体系产生的·OH有很好的清除作用，随着桂西生姜总黄酮提取液浓度的增加，对·OH自由基的清除能力也增强，说明当黄酮类物质的浓度增加时，其清除率也增大。

3讨论

实验结果表明，本实验方法工艺简单，回收率为%。利用本文所提供的超声波提取、纯化方法而得到的黄酮类物质其纯度较高，提取率是乙醇提取法的36倍。超声波可以强化乙醇浸提法，达到省时、高效、节能的目的，此方法采用全物理过程，无任何污染，是一条理想的提取黄酮类物质的途径，具有广阔的应用前景。

黄酮类化合物是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分，具有很高的药用价值。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇，其它包括双氢黄、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等［4］。天然来源的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障，能进入脂肪组织，进而体现出如下功能：消除疲劳、保护血管、预防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、抗脂肪氧化、抗衰老、活化大脑及其他脏器细胞的功能。黄酮类化合物具有抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎、镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射等作用［8,9］。近年来，世界上掀起了植物药开发的热潮，植物药以其天然低毒的特点倍受青睐，而黄酮类化合物以其广谱的药理作用引人瞩目。桂西生姜资源丰富。本文实验结果表明，桂西生姜中含有较为丰富的黄酮，其提取物总黄酮对羟自由基具有很好的清除作用。因此，桂西生姜具有广泛的开发和利用价值，值得综合利用，加强资源开发。

【参考文献】

［1］黄雪松，宴日安，吴建中.姜酚的生物活性述评［J］.暨南大学学报·自然科学与医学版，2005，26：434.

［2］李月文.生姜资源及开发利用［J］.中国林副特产，2005，：57．

［3］周孟清．生姜提取物的抗菌作用及其应用［J］.养殖技术顾问，2005，：17．

［4］夏杏洲，张辉，魏传晚.榕树叶中黄酮类化合物的提取条件研究［J］.食品研究与开发,2002,23(5):35.

［5］刘祥义.超声波提取元宝枫