动物染色体工程

动物染色体工程第一页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五AnimalChromosomeEngineering◆认识染色体与染色体组◆什么是染色体工程◆动物染色体工程的主要内容染色体组工程个别染色体工程人工染色体第二页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五一、认识染色体1.染色体的组成与DNA、基因之间的关系2.染色体的形态结构与分类3.染色体DNA的3种功能元件4.染色体组第三页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五1、真核细胞染色体的组成组蛋白：H1、H2A、H2B、H3、H4；非组蛋白：HMG、DNA结合蛋白DNA：不重复序列；中度重复序列；高度重复序列少量的RNA；第四页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五2、染色体的主要结构◆着丝粒(centromere)●主缢痕(Primaryconstriction)

◆次缢痕(secondaryconstriction)◆动粒(kinetochore)◆核仁组织区(nucleolarorganizingregion,NOR)◆随体(satellite)◆端粒(telomere)根据着丝点的位置而定，可将中期染色体分为四种：中着丝粒染色体、亚中着丝粒染色体、端着丝粒染色体、近端着丝粒染色体。第五页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五第六页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五染色体的超微结构核小体是染色体包装的基本单位；染色体包装的螺线管模型：第七页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五核小体的结构

每一个核小体核心包含有146bpDNA和8个组蛋白分子（2H2A，2H2B，2H3，2H4）；DNA在每个组蛋白核心外缠绕约2圈第八页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五染色体的串珠状形式与螺线管结构146bpDNA的核小体核心由54bp间隔DNA连成一条串珠状结构；核小体螺旋形缠绕形成螺线管结构，每一周螺旋含6个核小体，因此，DNA长度缩短了6倍。第九页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五第十页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五从DNA到染色体的包装压缩DNA链核小体螺线管染色单体超螺旋压缩比例：7×6×40×5=8400（1：7）（1：6）（1：40）（1：5）第十一页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五第十二页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五DNAPackaging第十三页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五GeneExpression第十四页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五3、染色体DNA结构稳定遗传的功能序列◆ARS(autonomousreplicatingsequence)◆CEN(centromericsequence)

Thecentromereisaspecializedregionofthechromosomethatplaysacriticalroleinensuringthecorrectdistributionofduplicatedchromosomestodaughtercellsduringmitosis

◆TEL(telomericsequence)

Thesequencesattheendsofeukaryoticchromosomes,calledtelomeres,playcriticalrolesinchromosomereplicationandmaintenance.第十五页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五DNA稳定遗传的三种功能位点第十六页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五第十七页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五4、染色体组◆染色体组◆染色体组型◆染色体倍性体细胞中的一组非同源染色体，它们在形态和功能上各不相同，但是，携带着控制一种生物生长发育、遗传和变异的全部信息，这样的一组染色体，叫做一个染色体组。

染色体组型是指一个体细胞中全部染色体的数目、大小和形态特征。

染色体倍性是指细胞中包含的染色体组数或基数。第十八页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五HumanmitoticchromosomesandkaryotypeChromosomepainting=multicolorFISH第十九页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五染色体组用符号“X”表示

生物体的体细胞染色体数用2n表示，无论是二倍体还是多倍体，2n只表示体细胞的染色体数，并不表示其倍性如：玉米体细胞染色体数2n=20，普通小麦体细胞染色体数2n=42，要正确表示倍性应写成：玉米2n=2X=20，普通小麦2n=6X=42。符号“n”和“X”的区别与联系单倍体与一倍体含义相同吗？第二十页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五AnimalChromosomeEngineering◆认识染色体与染色体组◆什么是染色体工程◆动物染色体工程的主要内容染色体组工程个别染色体工程人工染色体第二十一页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五骡子母马和公驴的后代第二十二页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五第二十三页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五为什么骡子不能繁殖后代？

马的染色体数是64条，驴的染色体数是62条，马的卵子染色体数是32条，驴的精子染色体数是31条，通过精卵结合发育成的新个体——骡子的染色体数是63条。骡子的染色体联绘紊乱因此骡子的生殖细胞不能分化发育成完整的个体。

第二十四页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五生育的概率极低骡子性成熟以后，再形成精子或卵子时，每条染色体都没有相对应的同源染色体进行配对，这样每一条染色体分到哪个配子里是随机的，在这些配子中，只有配子里的染色体完全来自于马的，或来自于驴的，这样的配子才有生育能力。

第二十五页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五狮虎兽（liger）

雄狮和雌虎交配产生的后代。狮虎兽的体型比狮或虎都要大，又同时具备两者之间的外貌特征；狮子与老虎相恋、怀孕的概率极低，即使在人工饲养的环境下，虎、狮受孕的机会也仅为1％至2％。幼兽由于先天不足等原因，成活率仅为五十万分之一左右。据资料显示，目前世界上存活的狮虎兽只有20只左右。

第二十六页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五狮虎兽（liger）

第二十七页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五狮虎兽狮虎虎狮兽第二十八页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五动物染色体工程染色体倍性改造结构改造人工染色体的利用第二十九页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五10.1.1动物的多倍体育种多倍体（polyploidy）:是指体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体多倍体产生机制：通过卵细胞第二极体的保留或受精卵早期有丝分裂的抑制而实现第三十页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五10.1动物染色体倍性改造定义：染色体倍性改造工程是指有目的、有计划地增加或减少一组或几组同源或异源染色体，以创造动植物新品种的一项染色体工程技术。主要包括多倍体育种和单倍体育种。第三十一页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五整倍变化：多倍体：细胞中含有三个或更多染色体组的个体单倍体：细胞中含有正常体细胞的一半染色体数非整倍体变化：染色体减少：单体（减1条）、缺体（减1对）染色体增加：三体（加1条）、四体（加1对）染色体代换：同种代换、异种代换第三十二页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五染色体数变异一是体细胞内以染色体组为基数进行的整倍性变化，以整倍体染色体数目变化产生的变异会产生多倍体和单倍体；另一种是染色体组内的个别染色体数目有所增减，使细胞内的染色体数目不是基数的的完整倍数，因此被称为非整倍体。第三十三页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五染色体结构变异易位：一个染色体上某一区段跟另一非同源染色体上的区段发生互换缺失：染色体的某一区段及带有的基因一起丢失倒位：染色体上某一区段连同它带有的基因顺序发生180度倒转重复：一个染色体上增加了相同的某个区段。第三十四页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五染色体结构变异染色体易位：一个染色体上某一区段与另一非同源染色体上的区段发生互换。染色体缺失：染色体的某一区段及其带有的基因一起丢失染色体倒位：染色体上某一区段连同它带有的基因顺序发生180度倒转。染色体重复：一个染色体上增加了相同的某个区段。第三十五页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五缺失：缺失一个片段。重复：某一片断重复出现。倒位：片段断裂，倒转180度，重新连接。易位：片段断裂，移到另一条染色体臂上。第三十六页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五10.1.1动物的多倍体育种1．染色体加倍技术(人工诱导)1).化学诱导法有些化学物质也可以用来阻止第二极体的排出或受精卵的有丝分裂而产生三倍体或四倍体。a.细胞松驰素B：能抑制肌动蛋白聚合成微丝，从而抑制细胞质分裂。第三十七页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五b.秋水仙碱：可以抑制细胞分裂中纺缍丝的形成，因而抑制有丝分裂。其它药物：N2O、CHCIF2和聚乙二醇等。缺点：化学药品一般比较昂贵、且具有毒性，影响处理后的胚胎发育，同时加上化学药物诱导产生的多倍体往往是在育种上没有价值的镶嵌体，所以化学方法在实际中的应用不及物理方法。第三十八页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五2)生物学方法生物学上主要通过杂交尤其是种间杂交获得异源多倍体。Rasch等（1965）年首次证明了三倍体脊椎动物可以通过杂交产生，他们将雌核发育的二倍体帆鱂（Poeciliaformosa）与P.Vittate杂交，得到三倍体后裔。例如用雌性草鱼（2n＝48）与雄性三角鲂（2n＝48）杂交可以获得子一代染色体数目为72的草鲂杂种三倍体。异育银鲫与兴国红鲤杂交获得的复合四倍体，通过细胞方法证明其产生的原因是受精卵发生了两性融合。这种不同科、属、种之间的远源杂交，会导致第二极体不排出，而产生多倍体。第三十九页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五

动物通过杂交方法尤其是种间杂交获得异源多倍体。种间杂交导致第二极体不排出。

草鱼♀×♂三角鲂

(2n=48)(2n=48)

草鲂杂种(3n=72)

第四十页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五第四十一页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五包括温度激变（温度休克法）、机械创伤、电离辐射、离心、水静压法和高盐高碱法等。⑴温度休克法：冷休克法（0～5℃）和热休克法（30℃）。定义：用略高于或略低于致死温度的冷或热休克来诱导三倍体或四倍体的方法。关键：能否成功地阻止第二次成熟分裂或第二极体的排出。要达到这一点，必须考虑温度处理的开始时间（TA）、处理持续时间（D）和处理温度（T）这三个因素。3).物理学方法第四十二页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五目前对鱼类使用温度休克法诱导三倍体的工作报道较多。一般来说，冷水性鱼类如鲑科种类应用热休克法好，而温水性鱼类用冷休克效果较好。优点：廉价、易操作，是诱导动物细胞多倍体化的常用手段，也有利于大规模生产使用。第四十三页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五⑵水静压法：采用较高的水静压（65kg/cm2）抑制第二极体的放出或第一次卵裂来产生多倍体。优点：诱导率高（一般在90％～100％）、处理时间短（3～5min），对受精卵损伤小、成活率高。缺点：需要专门的设备——水压机，成本较高，其样品室容量有限，处理卵的量有限，所以不适于大规模生产的。第四十四页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五◆Assemblyofmicrotubules●Assemblyinvitro影响微管稳定的因素第四十五页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五2．多倍体的倍性鉴定（1）直接法

1）染色体计数：是鉴定多倍体的一个准确的直接方法，但比较费时。

2）DNA含量测定：细胞DNA含量测定是倍性鉴定的另一个有效的直接方法。（2）间接法

1）体积测量

2）蛋白质电泳

3）生化分析第四十六页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五第四十七页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五

核体积测量：二倍体/三倍体核体积之比为1:1.5，二倍体与四倍体的核体积之比为1:1.74。核体积测量法省时、简单，在生产现场就能进行而广为人们采用，但缺乏准确性，亦测不出嵌合体，往往需要校正；生化分析：如在关东系银鲫中，三倍体红血球的丙酮酸激酶的含量含著高于二倍体。第四十八页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五

染色体计数：是鉴定多倍性倍性的一种最为准确、直接方法，但缺点是费时；

DNA含量测定：流式细胞仪。是较为先进常用的方法，其测定快速准确，并能测出嵌合体，但需要特殊的仪器设备。采用何种方法均有利有弊，进行鉴定主要依赖于所测样本的发育时期、实验要求和所具备的仪器设备条件。第四十九页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五流式细胞仪

FlowCytometry

Flowcytometryusesanelectronicinstrumentthatpassesparticlesorcellsonebyonethroughalaserandpastsensorsthatmeasurephysicalandchemicalcharacteristicsofthoseparticlesorcells.第五十页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五3、优点与缺点a.优点多倍体育种技术方法简单、见效快，有潜在的理论和应用价值。许多诱导的多倍体动物如两栖类、鱼类、贝类等都具有良好的生存力和生长率。种间杂种生长快，可以同时具有两个不同的种的优良特性。利用三倍体不育的特性，将生殖腺发育消耗的能量用于动物生长，可以避免因繁殖季节及肉质下降而延误上市时间或影响商品价值，缩短了养殖周期，减少了养殖成本，这在鲍鱼、昆虫等方面已有应用。某些多倍体动物肉质量、含氧量、抗病性等经济性状较二倍体好。第五十一页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五准确的处理时间；诱导率、成活率及孵化率的提高；准确可靠的倍性鉴定方法的确定。b.缺点第五十二页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五3.人工诱导多倍体的意义

多倍体(polyploidy):

多倍体动物如两栖类、鱼类、贝类都具有良好的生存力和生长率水产养殖增强抗病能力、提高生长速度第五十三页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五第五十四页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五特点多倍体与二倍体相比，最显著的特点是形态上的巨大性。糖类、蛋白质及其它产物的含量也有所提高。由于多倍体动物具有生长速度快、成活率高及抗病能力强等特点，所以可通过人工诱导多倍体来改善生物的经济性状。第五十五页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五三倍体triploid第五十六页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五人工诱导三倍体的方法直接途径，即用物理或化学的方法对受精卵进行处理，阻碍第二极体外排。间接途径，即首先诱导获得四倍体，待四倍体个体性成熟后再与二倍体个体自然交配，获得三倍体。第五十七页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五第五十八页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五鱼类三倍体育种的意义

三倍体是非偶数染色体组，故阻碍了生殖细胞正常的减数分裂，结果导致性腺不能发育。不育的三倍体经济鱼类因为没有性成熟阶段性腺发育的能量损耗，所以有以下优点：避免了性腺发育阶段和产卵季节鱼肉质量下降并延长了上市时间避免了性腺发育阶段的生长停滞和死亡率增加缩短了养殖周期，减少了养殖成本并可养成大型个体第五十九页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五利用三倍体鱼类不育性的优点，人们可以达到这样的目的：①获得生长速度较快的三倍体品种，提高鱼类养殖的经济效益②控制养殖鱼类的过度繁殖和防止对天然资源的干扰第六十页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五湘云鲫由湖南师范大学生命科学学院刘筠院士培育

第六十一页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五第六十二页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五TriploidGrassCarp三倍体草鱼第六十三页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五3．动物多倍体育种的意义1）多数具有良好的生长率2）低等动物的种间杂交优势非常明显3）巨大性4）育性低(四倍体可育)第六十四页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五10.1.2动物的单倍体育种（一）、人工单性生殖（二）、人工诱导雌核发育的方法（三）、雌核发育的鉴定第六十五页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五（一）、人工单性生殖1.雌核发育：（gynogenesis）是单性生殖的一种，指卵子依靠自己的细胞核发育成个体的生殖行为。同种或异种精子进入卵内只起刺激卵子发育的作用，不形成雄性原核和提供遗传物质，其子代的遗传物质完全来自雌核，只具有母本的性状。第六十六页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五自然界中一些无脊椎动物和鱼类等存在。人工诱导：雌核发育是指用经过紫外线、X射线或γ射线等处理后的失活精子来“受精”，再在适当时间施以冷、热、高压等物理处理，以抑制第二极体的排出，使卵子发育为正常的二倍体动物。第六十七页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五凡雌核发育的个体，都具有纯母系的单倍体染色体组，依赖于卵子染色体组的二倍体化。1911年，赫特威氏就第一个成功地人工消除了精子染色体活性，并发现了“赫特威氏效应”。赫特威氏效应指只有在适当的高辐射剂量下，才能导致精子染色体完全失活，届时精子虽能穿入卵内，却只能起到激活卵球启动发育的作用。第六十八页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五抑制第二极体外排抑制第一次卵裂精子遗传物质失活第六十九页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五Haploidembryosaregeneratedby'mock-fertilizing'eggswithUV-irradiatedsperm(whichcannotcontributegenetically),andcansurviveafewdays.Haploidscanberescuedbysuppressingformationofthepolarbodywithpressuretreatmentshortlyafterfertilization.

抑制第二极体外排第七十页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五朱

洗

细胞学家。浙江临海人。1931年获法国国家博士学位。中国科学院实验生物研究所研究员、所长。长期从事两栖类、鱼类、家蚕等动物卵子成熟、受精等研究。1961年使人工雌核发育的雌蟾蜍与雄蟾蜍交配，繁殖出没有外祖父的蟾蜍，证明了单性生殖的高等动物仍保有传代的能力。第七十一页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五2.雄核发育：用经过紫外线、X线或ｒ线处理的卵子与正常的精子受精，再在适当时间施以冷、热或高压等物理处理，使进入卵子内的精子染色体加倍，而发育成完全为父本性状的二倍体。定义：遗传失活的卵子与精子结合，发育成只有父本染色体个体的一种特殊生殖方式。第七十二页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五一、人工诱导雌核发育的方法第七十三页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五物理方法：采用射线包括γ射线、X射线（效果较好）和紫外线（效果较差）等处理精子使精子的遗传物质失活。

化学方法：采用化学物质如甲苯胺蓝、乙烯尿素和二甲基硫酸等消除精子染色体遗传活性的方法。

显微手术法：采用显微操作的方法直接去除受精卵中雄性原核的方法。1.精子遗传物质的失活第七十四页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五阻止第一次有丝分裂或第二极体的外排；利用温度、压力或化学方法，如冷休克、热休克、流体静水压、细胞松驰素B、聚乙二醇处理等。2.雌核染色体数目减少的阻止第七十五页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五首先将两个不同品系的近交系进行杂交。交配后，在精核与卵核尚未融合之前，从母鼠子宫内冲取受精卵，并用极细的吸管将精核去掉。在细胞松驰素B的处理下使雌核加倍，形成二倍体细胞。二倍体细胞在体外培养到囊胚期后，移植到养母的子宫内，使胚胎继续发育，直至出生。第七十六页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五二、雌核发育的鉴别第七十七页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五鉴别雌核发育的个体，通常以颜色、形态以及生化等方面的指标为依据。也可以通过细胞学的研究，如若是雌核发育，其囊胚细胞中只出现一套来自雌核的染色体，否则雌核和雄核染色体各占一半，得到的是杂交种。用遗传标志的方法来鉴别雄核发育的二倍体化，即由第一次有丝分裂的阻碍，还是由保留极体而来。假如二倍体源自第一次有丝分裂的抑制，杂合雌性个体的子代应该都是纯合型；而如果是通过阻止第二极体的外排产生的雌核发育个体，则子代的情况取决于着丝点与基因间的距离。在着丝点与基因距离远离时，将明显增加杂合型子代的比例。第七十八页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五三、雌核发育的意义第七十九页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五为生产单性种群提供了可能。能迅速地产生同源型二倍体。提供某些致死突变种的生物品质。在农牧渔业生产中，可人工控制性别繁殖。广泛地用于进行基因-着丝点的定位研究。可利用产生新的纯系来筛选除去有害的等位基因。第八十页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五四、人工诱导雄核发育第八十一页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五雄核发育（androgenesis）是指因经过紫外线、X射线或γ射线处理的卵子与正常的精子受精，再在适当时间施以冷、热或高压等物理处理，使进入卵子内的精子染色体加倍，而发育为完全为父本性状的二倍体。雄核发育的个体的生存率非常低，这是由于精子基因型的纯合性、卵子由于照射的损伤和阻止第一次卵裂处理的损伤等原因造成的。但是仍旧在遗传学基础理论和育种中都有一定的价值，利用雄核生殖的精子可用于冷冻基因库，保存种质资源，对基因世代克隆系的建立，不同种间核质的杂种的产生和YY雄性引起的性别控制等也有特殊的意义。第八十二页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五第三节染色体显微操作技术染色体分离染色体微切割第八十三页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五1.原理：由于荧光染料Hoechst只对A-T特异性染色，而染料Chromomycin只对G-C特异性染色。染色体上DNA的碱基序列是不同的，因此这些特异性染料和不同染色体上DNA结合的量和比例是不同的。结合这些染料后，再经激光照射，染色体就会呈现不同的荧光带。将特定染色体发出的荧光波长输入计算机，通过计算机控制就可将发出同一波长的染色体收集在一起，从而实现染色体的分离。一、

染色体分离第八十四页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五细胞分裂同步处理染色体的荧光色素染色染色体分离2.染色体分离的具体步骤第八十五页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五第八十六页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五微细玻璃针切割法：采用特细的玻璃针（尖端直径约为0.17μm）在倒置显微镜下对目的基因所在染色体区段进行切割与分离。显微激光切割法：将染色体标本在底部贴有特殊薄膜的培养皿上制作，利用激光共聚焦扫描显微系统，依靠高能量激光照射非选择细胞或染色体，使其受热蒸发，最后只留下目的染色体。二、

染色体微切割第八十七页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五第四节染色体转移技术微细胞介导的基因转移法染色体介导转移法第八十八页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五将同特定基因表达有关的染色体或染色体片段转入受体细胞，使该基因得以表达，并能在细胞分裂中一代又一代地传递下去。该技术称为染色体转移（或染色体转导）。微细胞介导的基因转移法（Microcellmediatedgenetransfer，MMGT）染色体介导的基因转移法（Chromosomemediatedgenetransfer，CMGT）第八十九页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五一、微细胞介导的基因转移法微细胞（或微核体）：是指含有一条或几条染色体，外有一薄层细胞质和一个完整质膜的核质体。供体：微细胞优点：简化供体基因的表达、对受体细胞影响小、微核染色体稳定第九十页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五微细胞制备微细胞融合第九十一页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五1.微细胞的制备用化学药剂和（如秋水仙素）阻断供体细胞的有丝分裂，使染色体停滞在有丝分裂中期，从而在染色体周围逐渐形成核膜而成为众多的微核。然后在细胞松弛素B的作用下使微核逐渐突出细胞膜外。最后经过离心获得含有一个微核、四周有一薄层细胞质和质膜界限的微细胞。第九十二页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五2.微细胞的融合制备的微细胞只能存活几个小时，但经融合可使其成为能够存活的整体细胞。常采用PEG作为细胞融合剂。最好选用带有营养缺陷标志的受体细胞。由于微细胞的染色体含有互补的原养型基因，微细胞与受体细胞形成的杂合细胞即可在特定的选择性培养基中生长而被筛选出来。第九十三页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五染色体介导转移法：是指分离得到相应的染色体后转入受体细胞的一种技术。基本步骤：⑴诱发细胞同步分裂；⑵阻断细胞分裂于中期；⑶破碎细胞；⑷离心收集中期染色体；⑸通过适当的分类转移到受体细胞中去。二、染色体介导转移法第九十四页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五细胞同步化与染色体的分离染色体的转移受体细胞的分离与鉴定染色体介导转移的过程第九十五页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五1.细胞同步化与染色体的分离用秋水仙素及合适的酶处理对数生长期的细胞离心收集中期相细胞沉淀洗涤数次在中性缓冲液中培育用注射针喷射细胞，使染色体释放离心收集染色体沉淀蔗糖梯度离心或用流式细胞测量仪分离单条染色体第九十六页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五2.染色体的转移染色体可以通过细胞的吞噬作用而进入受体细胞。一般先采用磷酸钙和染色体一起沉淀，再用二甲基亚砜处理受体细胞，或采用卵磷脂与胆固醇制成的脂质体将染色体转入受体细胞。第九十七页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五分离：利用选择性培养基进行筛选鉴定：染色体组型分析同工酶分析其他方法3.导入基因的受体细胞的分离与鉴定第九十八页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五第五节人工染色体第九十九页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五染色体要确保在细胞分裂中保持稳定，必须要能够自我复制和向子细胞中平均分配。它需要3个关键序列，包括自主复制DNA序列（autonomouslyreplicatingsequence，ARS）、着丝粒DNA序列（centromereDNAsequence，CEN）和端粒DNA序列（telomereDNAsequence,TEL）。

第一百页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五将3个关键序列用分子生物学方法拼接起来就得到人造微小染色体（artificialminichromosome），在大片段DNA分子的克隆、基因组分析、基因功能鉴定、基因治疗以及研究染色体结构与功能关系等研究中得到了广泛的应用，具有极为重要的价值。目前，正在研究或应用的有：酵母人工染色体（yeastartificialchromosome,YAC）细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome,BAC）哺乳动物人工染色体（mammalianartificialchromosome）第一百零一页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五基于ARS、CEN、TEL是线性染色体稳定的功能序列，人们利用这些序列构建载体，重组后的DNA以线性状态存在，这样不仅稳定，而且大大提高了插入外源基因的能力，并且可以像天然染色体一样在寄主细胞中稳定复制和遗传，称为人工染色体。如利用从酵母染色体上分离的ARS、CEN、TEL序列构建载体，然后用这种载体构建的染色体即称为酵母人工染色体。第一百零二页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五

第一百零三页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五

第一百零四页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五第一百零五页，共一百一十五页，编辑于2023年，星期五【复习思考题】经常采用的人工诱导多倍体形成的手段有哪些？要达到实验条件下二倍体雌核发育目的需要解决哪些问题？选择、判断题：1911年，人工条件下，

第一个在适当的高辐射剂量下成功地人工消除了精子染色体活性，导致精子染色体完全失活。

A.赫特威氏B.沃克C.克拉克D.摩尔根多倍体的鉴定不宜采取的方法是

。

A.核体积测量B.染色体计数C.血平板计数

D.利用血液成分、酶的含量等进行生化分析温度休克法包括冷休克法（0～5度）和热休克法（30度左右）两种，即用略高于或略低于最适温度的冷或热休克来诱导三倍体或四倍体的方法。测定细