PCR技术(包含引物设计)

〔PCR〕原理：原理：DNA聚合酶与启动子的参与下，依据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在试验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。DNA的变性和复性，并设计引物做启DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复PCRDNA的自然复制过程，其特异性依靠于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。列两端互补的寡核苷酸引物。PCR退火(复性〕延长三个根本反响步骤构成：DNA94℃左右确定时间PCRDNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反响作预备；DNA经加热变性成单链DNA单链的互补序列配对结合；DNA-DNAdNTPDNA链互补的半保存复制链，重复循环就可获得更多的“半保存复制链”，而且这种链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。技术分类〔常用〕PCR,IPCR)PCR是克隆序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在序列中DNA的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA序列内部的酶切位点分布状况。用不同的限制性内切酶消化，PCR获得未知片PCR,APCR)：用酶法在一通用然后以此序列为cDNA进展扩增APCR。PCR)：两种引物浓度比例PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度50～100÷110～15个循环中,高浓度引DNA。transcriptionPCRRT-PCR)：当RNA时cDNA才能进展扩增。应用格外广泛无论是分子生物学还是临床检验等都常常承受。增以提高模板量,然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带,此为巢式PCR。假设用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些且用量较少PCR时承受较高的退火温度而PCR时,由于较高退火温度下内引物不能与模板结合故只有外引物扩增产物经过假设干次循环待外引物根本消耗尽PCR产物,PCR扩增。这不仅削减操作步骤,PCRPCR，DNA模板的扩增。PCR)：在同一反响中用多组引物同时扩增几种基因片段,假设基因的某一区段有缺失,则相应的电泳谱上这一区带就会消逝。主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。PCRPCRPCR扩增体系中,5’-3’-端引物上带上一段PCR扩增产物,经变性和复性,PCR产PCR条件下发生聚合延长反响,产生一个包含两个不同基因的杂合基因。PCR技术：利用完整的细胞作为一个微小的反响体,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进展ＰＣＲ扩增，可进展细胞内定位，适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。PCR技术反响动力学反响动力学DNA扩增量呈指数上升，最Y=(1+X)n计算，YDNA片段扩增后的n表示循环次数。平均扩100%，但实际状况达不到，反响初期靶序列产物的渐渐积存，被扩DNA聚合酶数量和活性、PCR扩增效率、非特异性产物的竞争等因素有关。扩增产物5’端之间，是需要扩增的特定片段。短、长产物片段是由于引物所结合的模板不同而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反响周期中，以两条互补的35’端是固定的，内，形成长短全都的短产物片段。由于短产物片段是按指数倍数增加，而长产物片段则以算术倍数增加，故可无视不计，使DNA内，形成长短全都的短产物片段。由于短产物片段是按指数倍数增加，而长产物片段则以算术倍数增加，故可无视不计，使DNA片段供分析、监测。DNAdNTP、Mg2+引物设计20bp左右。的片段。G+C40-60%为宜，G+C太少扩增效果不G+C过多易消灭非特异条带。ATGC最好随机分布，引物3个，一对引物间也不易多于四个Tm值应当协调：Tm=4〔G+C〕+2〔A+T〕】④避开引物内部消灭二级构造，避开两条引物间互补，特别是3”端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。PCR延长的起始端，不能进展任3‘端也不能发生PCR扩增特异性影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。同源性。最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的时机。0.1～1umol10～100pmol最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的时机。TaqDNA聚合酶供给，一种是从栖热水生杆菌中提纯的自然酶，另一种为大肠菌合成的基因PCR0.5-2.5U/50ml，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量削减。的质量与浓度：dNTP溶液呈酸性，使用时应配成1MTris-HCLPH调整dNTPdNTP50～200umol/L，尤其是留意4dNTP的浓度要相等等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低PCR产物的产量。靶基因)PCR成SDS和K来消化处理标本。SDS的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDSK能水解DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核PCR反响。PCR扩增的特异性和产量有显著的dNTP浓度为200umol/L为宜。Mg2+浓度过高，反TaqDNA聚合酶的活性，使反响产物削减。RT-PCR的反转录〔RT〕cDNA的聚合酶链式扩增〔PCR〕相结合的技术。RT-PCR法：1mlTrizol冰上抽打匀浆〔边匀浆边暂停〕5min5min12023rpm，15min1.5mlEP管中，加等体10min12023rpm，10min〔4℃保存〕，振荡混合7500rpm，5min20min(EP管倒置在滤纸上)RNA沉淀枯燥〔不能完全枯燥〕3-5min(或手握充分溶解〔-70℃〕RNA18s、28s条带，分光光度吸光度比值DEPC水+5ulRNA〔150倍〕ug/ml=OD260×40×150ug/ml=OD260×6ug/ul之间260/280的比值看是不是28s、18s、5s的三条带是不是清楚，一般质量好的RNA，28s:18s的亮度比例在2:1-20℃保存，长期-70℃保存〕反响体系：20ul体系一步：约20分钟抽提物 引物 RNAsin 0.5μl6515分钟2、马上放入冰浴其次步：约2小时RNAsin 0.5μl10mMdNTP 缓冲液 4μl25mMMgCl2 AMV 3μl1.5小时5-10分钟-20PCRPCR反响体系：100μl体系小时5小时25mMMgCl22μl3μl缓冲液5μl5μl10mMdNTP1μl1μl上游引物2.5μl2.5μl下游引物2.5μl2.5μl模板2.5μl5μlddH2O34μl30μl酶 0.5μl 1μl轻质石蜡油 50μl 50μl1分钟，7221个循环秒，72130/40个循环7210分钟4℃保存，5分钟后-20℃保存或走电泳1.25小时300ml1.7%〔40ml0.5×TBE0.68g胶〕，微波2μl〔10mg/ml0.5μg/ml〕，充分混匀30-后现进展电泳反响产物+2μlDNAmarker5V/cm6、在紫外灯下观看,DNA存在则显示出红色荧光条带,承受凝胶)：Tris54g27.5g、0.5M1000ml5×TBE0.5×TBE就可以在电泳时使用(工作浓度)。(6×缓冲液，4℃保存)：0.25%溴酚蓝、0.25%二30%甘油〔1.0%〕1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，(假设首次煮胶，确定要煮透，以不消灭泡沫6010mg/ml溴化乙锭5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在4度冰箱加快琼脂糖凝固)后现1.5g。试剂：DEPC1000ml容量瓶中加双蒸水定1‰DEPC水，并充分振荡混匀备用。乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存。1.DEPC水的瓶子在盖子40-45分钟，所以水要适当多加一点；3.高压完毕后，不要强行放气，要让压力自然下降，不然水会喷出)。3、异丙醇：放入棕色瓶中。4、氯仿：放入棕色瓶中。5、轻质石蜡油RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中胞并