基因工程常规技术聚合酶链式反应

基因工程常规技术聚合酶链式反应第一页，共二十三页，编辑于2023年，星期五(polymerasechainreaction,PCR)聚合酶链反应SectionFour第二页，共二十三页，编辑于2023年，星期五一、什么是PCR?是体外核酸扩增技术。1985年美国PE-Cetus公司的K.B.

Mullis等发明的。DNA是由四种碱基按互补配对原则组成的螺旋双链。在细胞内，DNA复制时，解螺旋酶首先解开双链让它变成单链做为模板，然后，RNA聚合酶合成一小段引物（primer）结合到DNA模板上，最后，DNA合成酶以这段引物为起点，合成与DNA模板配对的新链PCR就是在体外模拟DNA复制的过程，它用加热的办法让DNA片段变性变成两条单链，让人工合成两个引物结合到DNA模板两端，DNA聚合酶即可以大量复制该模板。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点第三页，共二十三页，编辑于2023年，星期五AGAACTTTCTTGAAAGAACTTTCTTGAATCTTGAAAGAACTT亲代DNA子代DNA二、PCR的基本原理DNA的复制(replication)

由亲代DNA合成两个相同的子代DNA的过程第四页，共二十三页，编辑于2023年，星期五（一）原理

在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应

PCR反应扩增的是一对引物之间的DNA片段第五页，共二十三页，编辑于2023年，星期五（二）基本过程变性：加热使双链DNA变为单链退火：降温使引物和互补模板在局部形成杂交链延伸：耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物为起始点的延伸反应第六页，共二十三页，编辑于2023年，星期五第七页，共二十三页，编辑于2023年，星期五第八页，共二十三页，编辑于2023年，星期五第九页，共二十三页，编辑于2023年，星期五（三）PCR基本反应以DNA为模板的反应反应体积：50~100μLbuffer引物一对底物：4种dNTP模板：102~105拷贝耐热DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）矿物油模板DNA的用量可根据其分子量的大小调整第十页，共二十三页，编辑于2023年，星期五PCR缓冲液在PCR体系中Buffer通常采用10mmol/LTris-HCl（pH8.3-9.0），其中的二价阳离子（通常为Mg2+）可以激活DNA聚合酶的活性中心，Mg2+的浓度可影响PCR扩增产物的特异性。K+（50mmol/L）利于引物与模板的退火明胶或血清白蛋白及去污剂（Tween20）起到对TaqDNA聚合酶的稳定作用第十一页，共二十三页，编辑于2023年，星期五第十二页，共二十三页，编辑于2023年，星期五循环参数变性温度和时间：按模板DNA复杂程度来调整变性温度和时间。94℃，1min；95℃，30s；97℃，15s；退火温度和时间：45~55℃，30s~1min延伸温度和时间：72℃，时间因扩增片段的长度而异：1kb，1min；3~4kb,3~4min循环次数：25~35次，视最初靶分子浓度而定第十三页，共二十三页，编辑于2023年，星期五（一）PCR引物设计PCR效率和特异性取决于两个方面：一是引物与模板的特异结合，二是聚合酶对引物的有效延伸。三、PCR相关知识第十四页，共二十三页，编辑于2023年，星期五PCR引物设计原则1.引物长度一般15~30个核苷酸。引物过短会使PCR的特异性降低，过长会提高相应的退火温度，并使延伸温度超过TaqDNA聚合酶的最适温度74℃,亦会影响产物的生成，且合成引物成本增加2.引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶的堆积现象。尤其是引物的3′端不应有连续3个G和C。否则会使引物在模板的G+C富集序列区错误配对。引物中G+C的含量在45~55%左右。设计引物时要考虑3′端和5′端引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物长度要确保解链温度不低于54℃3.引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。一般引物自身存在的连续互补序列，不超过3bp4.两引物之间不应存在互补序列，尤其是3′端第十五页，共二十三页，编辑于2023年，星期五5.引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。尤其是引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。6.引物3′端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3′端的最佳碱基选择是G和C。因为它们形成的碱基配对比较稳定。7.引物的5′端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素，荧光物质，地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子等。在PCR的起始反应中，引物5′端游离的碱基并不影响引导新生链DNA合成的能力。但在后续的扩增循环中，这些与初始模板不配对的序列被带到PCR产物的双链中去，所以如此引物参与的PCR产物，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列第十六页，共二十三页，编辑于2023年，星期五（二）模板的取材病原体标本：病毒、细菌、真菌、螺旋体、立克次体、支原体等病理生理标本：细胞、血液、绒毛、尿液等法医学标本：血斑、精斑、毛发考古标本第十七页，共二十三页，编辑于2023年，星期五（三）TaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶在75~80℃具有最高的聚合酶活性。75~80℃每个酶分子每秒可延伸约150个核苷酸，

70℃时60个核苷酸/秒以上。

55℃时22个核苷酸/秒；

37℃1.5个核苷酸/秒

22℃时0.25个核苷酸/秒。温度超过80℃时，合成速度明显下降，可能与引物和模板结合稳定性遭到破坏有关，72℃最适温度。第十八页，共二十三页，编辑于2023年，星期五TaqDNA聚合酶没有3′→5′外切酶活性。没有校正功能。对于30次循环的PCR扩增反应。此酶的错配率为0.1%～0.25%。TaqDNA聚合酶具有类似未端转移酶的功能，能催化dNTP加到DNA的3′-OH端。但对4种dNTP聚合到3′-未端的能力不同，对dATP的聚合能力高于其他3种核苷酸，因此PCR产物的末端总是带有两个A第十九页，共二十三页，编辑于2023年，星期五附：PfuDNA聚合酶此酶来自激烈热球菌（Pyrococcusfariosus），耐热性极好，在97.5℃半衰期大于3小时，具有35外切酶活性，催化DNA合成的忠实性比TaqDNA聚合酶高12倍，是目前使用最广泛的具有35外切酶活性的耐高温聚合酶第二十页，共二十三页，编辑于2023年，星期五上海闪晶分子生物科技有限公司

来自嗜热细菌（Thermusthermophilus）74℃温度下进行扩增，在95℃的半衰期只有20min。在Mg2+存在下以DNA为模板合成DNA，而在Mn2+存在下以RNA为模板合成cDNA。催化RT-PCR、反转录编号规格售价￥ZP00401100U400ZP00402500U1600ZP004031000U3000

TthDNA聚合酶第二十一页，共二十三页，编辑于2023年，星期五VentDNA聚合酶VentDNA聚合酶来自嗜热高温球菌（Thermococcuslitoralis）是一种高保真的耐热DNA聚合酶，其保真度比TaqDNA聚合酶高5倍。该酶具有高保真性的其中一个原因是自身具有3‘→5’核酸外切酶校读活性。在95℃温育1小时后，仍具有90%以上的聚合酶活性，耐热。VentR®（exo-）DNA聚合酶是VentDNA聚合酶经基因工程改造而得，