单基因遗传病的分子生物学检验-医学院课件

单基因遗传病的分子生物学检验

MolecularDiagnosisforMonogenicInheritedDiseasesDNAmRNA蛋白质转录反转录

翻译

核酸的分子杂交

基因结构异常基因表达异常PCR

DNA测序

Nothern-blot

实时荧光定量PCR

反转录PCR

蛋白质芯片

ELISA

蛋白组织化学染色Western-blot基因芯片

分子生物学检验的技术和方法Southern-blot

遗传病的分类单基因遗传病多基因遗传病体细胞遗传病线粒体遗传病染色体病

一、单基因遗传病分子生物学检验技术与策略导致单基因病产生的基因突变类型

基因突变点突变密码子插入和缺失外显子缺失或重复基因倒位基因融合动态突变动态性突变

以三核苷酸为单位的重复序列，在传递过程中不稳定，会发生扩展，即子代的重复次数往往较亲代大为增加，因此又称动态性突变。脆性X综合征：CGG重复。少年脊髓型共济失调：GAA重复。

……致病基因：能导致遗传病或与遗传病发生相关的基因。致病基因的遗传方式：单基因遗传和多基因遗传。单基因遗传病：发病涉及到一对等位基因，符合孟德尔遗传。单基因遗传方式常染色体遗传性染色体遗传常染色体显性遗传常染色体隐性遗传X连锁遗传Y连锁遗传二、单基因遗传病的分子生物学检验常用技术（一）等位基因特异性PCR（AlleleSpecific-PCR,AS-PCR）（二）限制性酶谱分析（restrictionmap

）

限制性核酸内切酶在DNA序列上有特异的识别和切割位点，当基因突变涉及该识别位点改变时，可通过酶切后的电泳分离，根据酶切片段长度及数目判定突变有无发生。（三）PCR-反向斑点杂交（PCR-reversedotblot，PCR-RDB）

将多个特异性探针固定于固相支持物，再将经PCR特异扩增的待测产物与之杂交。中间引物为突变引物（M）时，M只能退火结合于具有具有突变的等位基因上，阻碍了同方向正常引物（U）的延伸，故只能获得突变引物（M）与反向正常引物（D）所引导的较短扩增片段。(四)突变寡核苷酸延伸扩增（mutantoligonucleotideextensionamplification，MOEA）（五）裂口PCR（gap-PCR）跨越断裂点PCR，该法是在断裂点即缺失序列上下游分别设计特异引物，正常情况下（不存在缺失），由于正、反引物间DNA过长无法扩增；而当片段缺失时，正、反引物彼此靠近，可在一定条件下扩增出特异条带。因此，根据条带的存在判断是否存在缺失。三、单基因遗传病的分子生物学检验策略直接诊断策略间接诊断策略直接诊断策略前提：被检测的致病基因的正常结构和序列已经被阐明目的：检测DNA中的点突变、缺失、插入、倒位、重复或重排策略：静态突变：突变能稳定遗传，主要基因突变形式。

动态突变：突变DNA在遗传过程中进一步突变。

直接诊断常用的检测方法点突变：核酸杂交、AS-PCR、PCR-RFLP、基因芯片；PCR-SSCP、DGGE、DNA-Seq。片段突变：Southernblot、多重PCR、荧光原位杂交等。动态突变的检测：

Southernblot、PCR、DNA测序等技术。例如：脆性X染色体综合征（智力低下）间接诊断策略连锁分析：通过覆盖密度适当的遗传标记在患病家系中进行连锁分析，找到与某一遗传标记紧密连锁的致病基因座，从而确定该基因在染色体上的粗略位置。关联分析：在可能的候致病基因附近选择遗传标记，并在患者和正常个体之间比较，从而得到某一等位基因片段与致病基因关联的相对危险度。由于间接诊断是通过遗传标记的多态性分析染色体单倍型是否与致病基因连锁，从而判断被检者患病风险以及是否为治病基因携带者，因为间接诊断实际上也是患病风险的评估。遗传标记的选择是进行间接诊断的前提，也是获得准确诊断结论的保证。在选择遗传标记时，首先应该选择致病基因内部的标记，如果致病基因小，编码区内没有合适的遗传标记，则选择致病基因周围非编码区，选择最近的遗传标记。产前诊断方法四、产前诊断非创伤性超声波检查母体外周血血清标志物胎儿细胞检测创伤性胎儿镜羊水穿刺胚胎活检1、血红蛋白病2、血友病3、脆性X综合征4、家族性高胆固醇血症第二节血红蛋白病的分子生物学检验血红蛋白病是指由于编码血红蛋白的基因异常而发生的一类遗传性贫血。一类是珠蛋白分子结构的异常，如镰刀细胞贫血等。一类是珠蛋白生成障碍性贫血，也叫地中海贫血，主要是由于珠蛋白多肽链的合成速率不平衡所致。一、珠蛋白基因簇的结构特征分类：α珠蛋白基因簇

ζ基因α基因β珠蛋白基因簇ε基因γ基因δ基因β基因位置：

α珠蛋白基因簇:16p13.33

β珠蛋白基因簇:11p15.5＊α珠蛋白基因簇包括一个ζ基因、3个假基因(ψζ、ψα1、ψα2)、α2、α1

＊β珠蛋白基因簇包括ε、γ(Gγ、Aγ)、ψβ、δ、β不同阶段的血红蛋白基因表达和血红蛋白组成六种正常血红蛋白的肽链组成和正常人血中的浓度

血红蛋白种类

肽链组成

(分子式)

正常成人血中

的浓度（%）

HbA(A1)

α2β2

95～98

HbA2

α2δ2

2～3

HbF

α2γ2～1(胎儿期)

Gower1

ζ2ε2无（胎儿期早期）

Gower2

α2ε2无（胎儿期早期）

Portland

ζ2γ2无（胎儿期早期）二、异常血红蛋白病血红蛋白病：是由于编码血红蛋白的基因突变导致珠蛋白生成异常所引起的疾病。临床上常见四种：镰刀型细胞贫血（血红蛋白S病），不稳定血红蛋白病，氧亲和力增高血红蛋白，血红蛋白M（家族性紫绀症）(一)镰刀形红细胞贫血及分子机制概念：由于β珠蛋白基因错义突变引起的溶血性贫血，属于常染色体隐性遗传病。镰刀形红细胞贫血症是第一个被揭示的“分子病”。镰刀型贫血症是一种遗传性贫血症，属隐性遗传性疾病。患者的红细胞缺氧时变成镰刀形，失去输氧的功能，破裂造成严重贫血。镰刀形红细胞贫血症的分子基础例1、镰形细胞贫血病(HbS)

β基因第6位密码子GAG→GTGmRNA密码子GAG→GUG

蛋白质氨基酸谷氨酸→缬氨酸例2、血红蛋白C病(HbC)

β基因第6位密码子GAG→AAGmRNA密码子GAG→UUG

蛋白质氨基酸谷氨酸→赖氨酸镰刀形红细胞贫血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbSβ肽链HbAβ肽链N-val·his·leu·thr·pro·val·glu·····C(146)血红蛋白C病N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbCβ肽链HbAβ肽链N-val·his·leu·thr·pro·lys·glu·····C(146)机理：HbC的氧亲和力下降，氧化后结晶，红细胞僵硬，不能进行微循环，丢掉部分细胞膜而使红细胞变成小球形红细胞，其变形能力差，容易被单核吞噬细胞破坏发生溶血。(二)镰状细胞贫血的分子生物学检验原因：β珠蛋白基因发生点突变检验策略：限制性酶谱分析（RE）：最常用ASO探针杂交：AS-PCR等

某一限制酶识别位点移位的大片段缺失或插入，某一限制酶识别位点丧失或获得的点突变，均可引起相应限制性片段的长度和数量发生变化。分析限制性酶切图，即可诊断出此类突变。

×MstⅡ酶切位点(CCTNAGG)5´3´正常基因突变基因1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析0.2kb1.15kb5´3´+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切电泳分析受检者基因组DNA或含突变位点的PCR扩增产物与标记的ASO探针杂交主要适用于检测已知点突变ASO1ASO2βA

βsβs

βsASO探针杂交βA

βA（三）分子生物学检验的临床意义镰刀状细胞贫血的分子生物学检验针对发生突变的β珠蛋白基因开展，采用直接诊断策略，直接判断突变类型，区分出杂合子和纯合子，也可发现新的突变类型，也可用于镰刀状细胞贫血的早期诊断及产前诊断。三、珠蛋白生成障碍性贫血珠蛋白生成障碍性贫血：是由于珠蛋白链合成速率降低，引起α链和非α链数量不平衡造成的单基因遗传病。主要是：珠蛋白生成障碍性贫血（地中海贫血）

根据缺乏的珠蛋白链的种类及缺乏程度命名分类为：α、β、δ、γ、δβ、γδβ六种类型分布最广和最严重的是α和β生成障碍性贫血（一）α珠蛋白生成障碍性贫血及其分子机制Normal:

α2β2名称基因型描述基因型Α珠蛋白链的合成量临床症状静止型α珠蛋白生成障碍性贫血αA/α+αα/α-75%基本无症状标准型α珠蛋白生成障碍性贫血α+/α+α-/α-50%轻度贫血HbH病α+/α0α-/--25%代偿性溶血性贫血胎儿水肿综合征α0/α0--/--0死胎、新生儿死亡

α地中海贫血：不同数量(1-4个)α珠蛋白基因缺失分子机制：1.基因缺失：细胞减数分裂时α珠蛋白基因发生不等位交换点突变：α2中CTG突变为CCG,使得Leu被Pro取代。移码突变：α1珠蛋白基因中第14个密码子中一个核苷酸缺失。无义突变：α1珠蛋白基因中某个密码子变成终止密码子。mRNA加尾信号突变：突变发生在α2珠蛋白基因的3’端高度保守序列，致使无法进行加尾。终止密码子突变：α1珠蛋白链中氨基酸数目增加，稳定性下降。2.基因突变：（二）α珠蛋白生成障碍性贫血的分子生物学检验主要是由于α珠蛋白基因缺失，PCR是首选的检验策略；大范围缺失的检测主要是Southern杂交技术；针对非缺失型α珠蛋白生成障碍性贫血，可用SSCP、AS-PCR等；通过对绒毛膜细胞或羊水细胞、胚胎脐血进行DNA检测，可进行产前诊断,可防止纯合子患儿的出生。主要的检验策略包括：α地贫的基因诊断α基因不同程度的缺失引起不同类型的α地贫，α基因缺失1~4个。正常基因组用BamH1切割，可得到14kb的片段，而缺失一个α基因时得到10kb片段。1.PCR法

扩增片段产物不同可检出不同类型的α珠蛋白生成障碍性贫血。鉴别缺失的首选方法。

2.Southern印迹法

α地中海贫血的基因簇限制性酶切片段长度

α基因探针

ζ基因探针

BamHⅠEcoRⅠHindⅢEcoRⅠaa/aa142316.5，1323，5

--/----

20，1317，5

a3.7-/aa10.319.3NDNDa4.2-/aa9.818.8NDND493.AS-PCR

非缺失型α珠蛋白生成障碍性贫血的分子诊断和产前诊断。4.SSCP

非缺失型α2珠蛋白基因突变筛查，DNA在非变性PAGE电泳体系中的构象来鉴定DNA序列改变的一项技术。5.gap-PCR

通过PCR扩增产物带出现差异，可区分正常基因型和缺失型。（三）β珠蛋白生成障碍性贫血及其分子机制β珠蛋白生成障碍性贫血是由于β珠蛋白基因功能下降或缺失所致的一类遗传性溶血性疾病。点突变是该疾病的主要发病原因：发生在启动子区域

mRNA水平下降发生在剪接信号及附近区域异常mRNA不稳定发生在ORF影响β珠蛋白合成β地中海贫血常见突变位点（四）β珠蛋白生成障碍性贫血的分子生物学检验PCR-RDBPCR-ASOAS-PCR基因芯片MOEA（突变寡核苷酸延伸扩增）主要是点突变或移码突变，已发现170多种的核苷酸取代突变，PCR及点突变检测技术是主要技术。1.PCR-RDB缺点：仅能检测已知的点突变2.PCR-ASO当基因的突变情况完全明了时，可以合成等位基因特异的寡核苷酸探针（ASO），长度通常为20bp左右。一种探针与正常基因杂交，另一种探针与突变基因杂交，即将突变的基因区别开来。

PCR先将含有突变点的基因进行扩增，然后再与ASO探针作点杂交。优点是灵敏、准确，缺点是一次杂交只能检测一种突变。

AAATAAAGGC

产物

AAAAAAAGGC

产物TTTTTTTTTTATTT正常引物突变引物PCRPCR无突变突变杂合子3.AS-PCR574.基因芯片设计多个基因突变位点，采用PCR-RDB，一次性检测出样本中多个基因位点突变。5.MOEA（突变寡核苷酸延伸扩增）RT-PCRIVS-ⅠIVS-ⅡIVS-ⅠIVS-ⅡIVS-Ⅰ579654β

globingenemRNA(N)mRNA(M)ABC第三节血友病的分子生物学检验

血友病是一种遗传性出血性疾病。发病原因是由于患者的血液中由于基因缺陷先天缺乏某种凝血因子，根据缺乏因子的的不同分为三种类型:血友病甲(缺乏凝血因子Ⅷ,又称血友病A)、血友病乙（缺乏凝血因子Ⅸ，又称血友病B）和血友病丙（缺乏凝血因子XI）。血友病A和B均属X性隐性遗传，一般由女性传递，男性发病。血友病丙较少见，为常染色体不完全隐性遗传，男女均可发病，通常所说的血友病是指的血友病甲。一、血友病及凝血因子基因

甲型血友病（血友病A）发病的分子机制是FVⅢ基因突变，FVⅢ基因位于X染色体长臂末端（Xq28），包括26个外显子和25个内含子，全长186kb。遗传方式：X隐形遗传

突变主要为点突变或少数碱基的缺失和插入以及第22内含子的大片段倒位。

第22号内含子倒位的机制A3为远端重组，A2为近端重组

到1994年已报道的FVⅢ基因点突变174种，缺失117种，插入10种。由于导致病变的点突变多，在实际工作中不可能对每一对病人作点突变的检测，所以DNA多态性的连锁分析仍然是检测此疾病的常用手段。乙型血友病（血友病B）：其分子机制是分布于整个FⅨ基因各处的多种形式的突变。女性携带正常A1倒位（一）直接检验策略：LD-PCR（检验基因倒位）二、血友病A的分子生物学检验一个等位基因点突变是非倒位引起血友病A的主要原因，但FVⅢ基因突变无热点。

遗传标记检测都结合PCR技术，经过PCR扩增后再检测这些扩增片段的长度，即可了解被检样本的基因型，从而判断是否与致病基因连锁。（二）间接诊断策略：RFLP/STR/VNTR18内含子+连锁BCL1酶切位点是正常的突变基因A型血友病的分子诊断－PCR-RFLP连锁分析法A/B/CB/CC/DC/B/DPCR检测VNTR（st14DXS52）位点进行家系连锁分析位于Xq28，与FVⅢ紧密连锁两者相距2cm血友病B，又称Christmas病或血浆凝血酶成分缺乏，发病原因为编码FⅨ基因缺陷，导致含量缺乏或结构异常，从而使凝血功能障碍。FⅨ基因突变的种类繁多，700多种，具有十分显著的异质性，几乎每个家系都有其特异基因突变类型，再则FⅨ基因较小，因此给分子诊断带来一定困难。三、血友病B的分子生物学检验Southern印迹杂交DNA测序基因芯片毛细管电泳直接检验方法：RFLPSSCPDGGE法双脱氧指纹图谱变性高效液相色谱法间接检验方法：第四节脆性X综合征的分子生物学检验脆性X综合征（fragileXsyndrome,FraX）,常见的X连锁隐性遗传病，主发于男性，发病率为1/3500个新生婴儿。男性发病率1/1000-1/1500，智力低下10%-20%，大睾丸、长脸、大头、大耳、前额突出，下颌大而前突，嘴大唇厚发音障碍。

脆性位点是染色体上在特殊条件下易断裂的位点，可能为收缩或缝隙。在人类染色体上已发现一系列的脆性位点。其中研究最详尽的位于X染色体上，目前发现其与智障有关。脆性X综合症为X连锁遗传，出现几率在男婴中为1/2500，主要原因可能是因为CGG三核苷片段重复数目的变化。RNA结合蛋白脆性X综合征发病机制，是(fragileXmentalretardation,FMR-1脆性X智力低下1号)基因5’-UTR区有数目可变的（CGG）n三核苷酸重复，上游250bp存在CpG岛。（一）FMR-1基因5’端（CGG）重复序列异常扩增73（二）FMR-1基因5’端CpG岛的异常甲基化（三）FMR-1基因缺失基因启动子区域缺失660bp或25kb的DNA片段。（四）FMR-1基因点突变二、脆性X综合症的分子生物学检验（一）Southern印记杂交:根据待测样本CpG岛异常甲基化，选择甲基化敏感的DNA限制酶对DNA片段进行酶解，再设计针对突变位点的探针进行杂交，确认全突变和前突变。

12345678910111212男、女性对照，3男性前突变，4女性前突变（携带者），5全突变，6女性发病7男性对照，8女性对照，9男性前突变，10女性前突变，11男性发病，12女性发病（二）PCR：根据PCR产物的大小计算CGG重复拷贝而对异常扩增做出判断，大于200的CGG全突变不能呈现有效扩增，则再进行Southernblot。（三）微卫星序列分析：FMR-1基因两侧有三个连锁遗传标记（FraXAC1、FraXAC2、DXS548），采用PCR扩增中间标记基因分杂合率。第十四

章

染色体疾病的分子生物学检验第一节染色体异常与疾病1.染色体数目与结构2.染色体的数目异常与疾病3.染色体的结构异常与疾病一、染色体数目与结构体细胞46条常染色体（22对,44条）性染色体（1对,2条）女：XX男：XY生殖细胞23条卵细胞（22+X）精细胞(22+X)或(22+Y)

染色体组：人体正常生殖细胞精子和卵子都含有23条染色体，为一个染色体组。

纺锤丝

主缢痕

次缢痕染色质

染色单体

核粒

DNA双螺旋

微管染色质纤丝折叠蛋白DNA蛋白质(组蛋白)螺旋体超螺旋体着丝粒和纺锤体微管的连接部位DNA:1.74米细胞核:5微米

短臂随体着丝粒长臂

中央着丝粒染色体亚中着丝粒染色体近端着丝粒染色体人类中期染色体的形态结构Metacentric(1,3,16,19,20)Submetacentric(2,4-12,17,18,X)Acrocentric(13,14,15,21,22,Y)核型及分组核型（Karyotype）：指将一个细胞内的全部染色体按照一定的顺序排列起来所构成的图像。核型分析（Karyotypeanalysis）：对核型进行数目、形态特征分析，以确定是正常还是异常核型。

染色体异常是指染色体数目的增减或结构的改变，故分为数目异常和结构异常两类。染色体病是由于体内、外因素导致的先天性染色体数目异常或结构畸变而引起的疾病。临床上多表现为一组综合征。

以二倍体为标准，如果体细胞染色体数目超出或少于46条，称为染色体数目畸变。包括整倍性异常和非整倍性异常。二、染色体的数目异常与疾病（一）多倍体和整倍体体细胞的染色体不是由两个染色体组，而是三个、四个染色体组组成时，称多倍体。

1.三倍体：其细胞中有三个染色体组（3n=69）,是流产的重要原因之一，极少数存活。

产生原因：为双精子或双雌受精受精。23X23Y23Y69XYY69XXY23X23X23Y2.四倍体：含四个染色体组（4n=92）,全身性,更罕见，一般在流产胚胎，或者伴有多发畸形。产生原因：核内有丝分裂:因纺锤体的缺陷，细胞不能分裂所致核内复制:分裂前复制两次。体细胞中的染色体数不是染色体组的整倍数，而是比二倍体少或多一条或几条染色体，如亚二倍体（单体型），超二倍体（三体型）。

单体型（monosomy）某号染色体比正常减少一条，常染色体单体型是致死性的。临床上常见X染色体单体型，表现为Turner综合征。

三体型（trisomy）：某号染色体比正常增多一条。除部分三体型外，三体型多导致流产，但它是最常见的染色体数目异常类型。常见病Down综合征，Klinefelter综合征（二）异倍体或非整倍体临床上最常见的染色体异常引起染色体异常的因素：辐射诱变疾病影响药物损伤发育异常环境因素医疗措施三、染色体结构异常与疾病

非整倍体形成原因染色体不分离（nondisjunction）

有丝分裂不分离减数分裂不分离染色体丢失（chromosomeloss）染色体不分离：指某一对同源染色体或两条染色单体在分裂的后期不能正常分开，而同时进入某一子细胞，导致形成的子细胞中，一为超二倍体，另一为亚二倍体，这一过程称染色体不分离。

染色体丢失：分裂后期染色单体的滞留导致染色体减少。减数分裂I不分离正常减数I分离减数分裂不分离减数分裂II不分离正常减数II分离（一）染色体结构异常的类型

缺失（deletion，del）

环状染色体（ringchromosome,r）

等臂染色体（isochromosome,i）

倒位（inversion,inv）

易位（translocation,t）

重复（duplication,dup）

染色体结构的发生异常改变，称为染色体结构异常或染色体畸变。12345671234567重复（duplication,dup）

1234567123456712345675123467常见三种：（1）相互易位（reciprocaltranslocation）:两条非同源染色体同时发生断裂，其断片相互交换位置后重接，形成两条新的衍生染色体。易位（translocation）：两条非同源染色体同时发生断裂，两断片互换位置重新连接的现象

（2）罗伯逊易位（Robertsoniantranslocation）:又称着丝粒融合，指近端着丝粒染色体在着丝粒处融合的易位。RAB1234567RAB1234567B567（3）插入易位（insertionaltranslocation）:是指两条非同源染色体同时发生断裂，其中一条染色体的断裂片段插入到插入到另一染色体的非末端部位。（5）等臂染色体（6）环状染色体(二)染色体结构异常与疾病21三体综合征（Down综合征、先天愚型）1.三大特征:高严重智力地下、50%伴有先心、大多有皮纹改变2.其他表现：新生儿中1/800～1/600，随母亲年龄增加发病率提生长发育迟缓，智力低下，具有特殊的呆滞面容，伸舌有时流涎，又称伸舌样痴呆，男性不育、女性偶有生育能力。

3.类型及形成机制：1)完全型型（约占92.5%）：

47，XX（XY），+21原因：95%为母亲形成卵子时，发生21号染色体不分离，导致异常卵子（24，X，+21）与正常精子结合而成。发病率随母亲年龄增高而增大

46，XX（XY）/47，XX（XY），+21原因：受精卵卵裂时发生21号染色体不分离，形成嵌合体。３）易位型（约占5%）：常见14/21易位

46，XX（XY），-14，+t（14q；21q)原因：45%是由平衡易位携带者遗传而得。55%为新发生的。２）嵌合型（约占2%）：人类的14/21染色体罗伯逊易位型21三体2114q/21qTurner综合征（又称先天性卵巢发育不全综合征）发病原因：全部或部分体细胞中的一条X染色体部分或完全缺失所致。临床表现：身材矮小(120m-140m)，性发育幼稚,外生殖器和乳房幼稚型，乳间距宽，性腺为纤维条索状，无滤泡，子宫、不育。肘外翻，上眼睑下垂，后发际低，50%有蹼颈，皮肤色素增多。智力正常或轻度障碍。常见核型：X单体型45，X占55%左右产生原因:父亲或母亲形成生殖细胞时,发生性染色体不分离，导致异常生殖细胞受精所致。嵌合型

45，X/46,XX;45,X/47,XXX等。约占25%，易存活，症状较轻产生原因:受精卵卵裂时发生后期迟滞,X染色体丢失,形成嵌合体。X染色体短臂或长臂缺失

46,X,del(Xp)或46,X,del(Xq)X染色体长臂或X短臂等臂

46,X,i(Xq)或46,X,i(Xp)5p-综合征（“猫”叫综合征）

1.发病率：为1/50000，在常染色体结构畸变中占首位大部分患者能活到儿童期，少数可到成年

2.临床表现：患儿在婴幼儿时期的哭声似小猫叫，喉部畸形、松弛，小头，鼻塌、低耳位、牙错位咬合，手足小，肾畸形，脑积水，肌张力亢进，智力严重低下。3.核型：

46,XX(XY),del(5)(p15)脆性X综合征脆性部位(fragilesite)Xq27.3带有一脆性断裂点FMR-1人类染色体和染色体病FMR-1基因脆性X染色体综合征(fraXchromosomesyndrome)n=6～46；正常n=52～200；前突变n=200～230；患者5CGGCGGCGGCGGCGGCGG……临床特征中度到重度智力低下大头、方额，大耳、单耳轮，大下颌且前突语言障碍，性情孤僻性成熟后睾丸比正常人大一倍以上多数患者青春期前有多动症，但随着年龄增长而逐渐减轻第二节

染色体病的分子生物学检验技术1.荧光原位杂交技术2.多重连接依赖性探针扩增检测技术3.比较基因组杂交检测技术4.无损伤产前染色体病分子生物学检验技术一.荧光原位杂交（Fluorescenceinsituhybridization,FISH）原位杂交（ISH）原位杂交(insituhybridization,ISH)

将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交。使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。基本原理

根据碱基互补配对原则，同源的DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA两条单链在一定条件下能结合成双链。用放射性或非放射性物质标记的DNA、RNA或与mRNA互补的cDNA作探针，与组织切片或细胞内待测核酸(RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DAN的存在与定位。原位杂交技术种类基因组原位杂交技术

荧光原位杂交技术

多彩色荧光原位杂交技术

原位PCR3H、35S、125I、32P等原位杂交常用标记物质70年代80年代中后期放射性同位素12荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质2一、荧光原位杂交技术

荧光原位杂交（Fluorescenceinsituhybridization，FISH）是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法，探针首先与某种介导分子(reportermolecule)结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。（一）FISH的基本原理FISH基本原理是利用同源互补的待检染色体与用荧光标记过的核酸探针，经变性-退火-复性，形成待检DNA与核酸探针的杂交体。使探针与荧光素标记的特异亲和素之间发生免疫化学反应，最后用荧光显微镜对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。对于较大片段的靶核酸序列直接采用荧光标记的核酸探针，对于较小的靶核酸序列先用生物素或地高辛标记探针，再用荧光标记的单克隆抗体进行免疫化学检测二、FISH技术的特点

多彩色荧光原位杂交FISH样本的制备探针的制备探针标记杂交（染色体显带）荧光显微镜检测结果分析实验流程（三）FISH技术的基本方法1.染色体结构数目异常的检测

产前诊断中对常见非整倍体异常分析（五）FISH技术应用2.基因在染色体的定位3.RNA表达的定性、定位及定量分析核型分析，虽可以准确检查胎儿染色体是否存在数量或结构异常，是产前诊断金标准，但时间长，2~4周。FISH在临床中的应用常见非整倍体异常的检测分析一些显带技术不易分辨的染色体异常人类基因在染色体上的定位原癌基因的定位病毒基因组在染色体中的整合5个FISH诊断项目二、多重连接依赖性探针扩增检测技术（Multiplexligation-dependentprobeamplicaiton,MLPA）5’3’通用引物序列Y通用引物序列X靶序列杂交序列靶序列杂交序列MLPA原理

每个MLPA探针含有两个荧光标记的寡核苷酸片段

包括：通用