兽医生物制品质量控制-兽医生物制品质量检验（仪器分析技术）

安全检验各种生物制品的安全检验必须按《兽药典》规定进行，安检合格方可出厂。安全检验4.检查对胚胎的致畸和致死毒性1.检查外源性细菌污染检验内容2.检查灭活或脱毒情况3.检查残余毒力或毒性物质安全检验方法：

成品的安全检验是利用动物进行接种试验，将生物制品按要求量接种到动物后，观察数日，动物应健康存活。安全检验1.动物的选择等级动物、敏感动物、并有一定的品种、品系、日龄等要求。凡能用小动物作出正确判断者，则多用实验小动物2.安检剂量安全检验的剂量应大于使用剂量安全检验3.安检要点及结果判定各种制品安检时，每批样品任抽3瓶充分混合，按规定进行检验和判定。例：猪丹毒灭活疫苗的安检，用体重18～22g小白鼠5只，各皮下注射疫苗0.3mL，观察10d，均应健活。安全检验如在安全检验期内，安检动物有死亡，应及时剖检取样培养，确属意外死亡时，作无结果论；如检验结果可疑，难以判定，应以加倍动物数进行重检；如不安全，则该批制品应予以报废。凡规定用多种动物进行安检的制品，多种动物都要合乎检验标准，否则不得出售。剩余水分的测定冻干制品均需测定水分含量。按《兽药典》规定，每批样品任抽4个，各样品剩余水分均不应超过4％。如不符，可重检1次，重检后如有1个样品超过规定，该批制品应判为不合格。其测定方法可采用真空烘干法或费休氏法。剩余水分的测定1.真空烘干法称量瓶称重将称量瓶置于真空干燥箱内移入干燥器中抽真空、加热打开箱门、盖好称量瓶烘干、冷却称后将样品倒入称量瓶内盖好称重打开瓶盖，关闭真空干燥箱待温度下降取出称量瓶冷却称重再移回干燥箱，继续烘干达到恒重减失的水量即为恒重剩余水分的测定含水率%=样品干前重量—样品干后重量样品干前重量×100%剩余水分的测定2.费休氏法是利用化学方法来测定制品的含水量。原理是水分能与碘、二氧化硫发生作用，1分子水与1分子碘化合成碘化物，溶液由原来的棕色变为无色。以此来判定终点，计算制品的含水量。无菌检验或纯粹检验根据《兽药典》规定，兽医生物制品（除另有规定者外）都不应有外源微生物污染，灭活疫苗不应含有活的本菌或本毒。各类生物制品必须按规定进行抽样作无菌检验或纯粹检验，全部操作应在无菌条件下进行。无菌检验或纯粹检验1.抽样对制造疫苗的各种原菌（毒）液和其他配苗组织乳剂、稳定剂及半成品，按每瓶（罐）分别抽样，抽样量为2～10mL。成品按每批瓶数的1%随机抽样，最少不少于5瓶，最多不抽过10瓶。无菌检验或纯粹检验2.检验用培养基（1）厌氧及需氧细菌检验用含硫乙醇酸盐培养基（T．G）及酪胨琼脂（G．A）；（2）霉菌及腐生菌检验用葡萄糖蛋白胨培养基（G．P）；（3）活菌纯粹检验用适于本菌生长的培养基；（4）杂菌计数用马丁琼脂或G．A；（5）病原性鉴定用T．G或其他适宜培养基。无菌检验或纯粹检验3.检验方法及结果测定（1）按《规程》中规定的方法进行检验无菌检验或纯粹检验（2）注意事项凡含有防腐剂、灭活剂或抗生素的产品必须用小瓶或大管培养基稀释后再移植培养；含有抗生素的冻干产品应稀释10倍后进行培养检查，以消除抗生素的影响；在厌氧菌检验时，除给予厌氧条件外，有些厌氧菌生长较缓慢，有些厌氧菌形成芽孢时间较长，故需适当延长培养时间才能获得确切的结果。无菌检验或纯粹检验例猪丹毒灭活疫苗的无菌检验50ml的TG37℃培养3d取培养物1ml待测制品各0.2ml于TG各0.2ml于GA斜面0.2ml于GP37℃25℃37℃25℃25℃要求:均培养5日，应无菌生长无菌检验或纯粹检验4.杂菌计数及病原性鉴定某些兽医生物制品，如绵羊痘活疫苗、鸡新城疫低毒力活疫苗等，按《兽药典》规定允许存在一定数量的非病原性杂菌，若经无菌或纯粹检验证明有杂菌，则必须对该制品进行病原性鉴定和杂菌计数后，才能对该制品做出合格与否的结论。无菌检验或纯粹检验（1）杂菌计数抽样（3瓶/批）分别作50倍稀释接种于平板上（2个平板/样品）37℃培养48h室温培养24h计录杂菌菌落数计算杂菌数如污染真菌时，也记为杂菌数。任何l瓶制品的非病原性杂菌不应超过《兽药典》的规定。无菌检验或纯粹检验(2)污染杂菌的病原性鉴定①污染需氧性细菌的检查37℃培养24h取培养0.1ml做100倍稀释皮下接种3只小鼠，0.2ml/只观察10天污染杂菌培养物移植T.G小管或马丁肉汤无菌检验或纯粹检验②污染厌氧性细菌的检查污染杂菌管延长培养至96h65℃加热30min再移植TG管或厌气肉肝汤将培养物肌肉接种2只豚鼠，1ml/只同条件下培养24-72h无菌检验或纯粹检验③判定结果上述接种动物均应健活。如有死亡或发生局部化脓、坏死，证明该批制品污染病原菌，应废弃全部制品。物理性状检验各种生物制品都应逐瓶检查其瓶装量是否准确，封口是否严密，包装是否整洁美观，瓶签有无差错及不清，内容物是否有异物等。物理性状检验1.液体疫苗与诊断液各种液体疫苗及诊断液均各有其规定的外在和内在的物理性状标准，凡变质者均应剔除；装量不足、封口不严、外观污秽不洁和标签不符者均应废弃。例如，灭活的氢氧化铝胶苗，静置时上部为黄棕色、黄褐色、粉红色或褐色透明液体，下部为氢氧化铝胶沉淀，振摇后为均匀的混悬液。物理性状检验2.血清制品各种血清制品应是微带乳光的橙黄色或茶色液体，不可有絮块、异物或浑浊，若有少量沉淀时，稍加振摇即变成均匀的混浊状。物理性状检验3.冻干制品应为微白、微黄或微红色海绵状疏松团块，无异物和干缩现象，安瓿口无裂缝及烧焦物。加水或稀释液后，常温下应在5min内迅速溶解。效力检验（2）（3）抗原量的测定生物制品的热稳定性免疫原性与免疫的持续期（1）1.内容效力检验（1）（2）（3）活菌计数与病毒量的滴定血清学试验2.检验方法动物保护力试验效力检验（1）动物保护力试验是兽医生物制品特别是疫苗类制品最常用的检验方法。所用动物因制品而异。其试验方法很多，多采用攻毒法，并设立对照组。效力检验①定量免疫定量强毒攻击法将待检制品接种动物，2-3周后，用相应的强毒攻击，然后以被攻击动物的存活或不感染比例判定该制品的效力。效力检验例：猪丹毒弱毒菌苗的效力检验免疫小白鼠5只（每只注射含1000万个猪丹毒弱毒菌的苗）—14天后，连同3只以上未免疫小鼠各攻击1000个小鼠致死量的猪丹毒强毒菌。要求：免疫鼠存活4／5以上，对照组全部死亡，菌苗才为合格。效力检验②定量免疫变量攻击法把动物分免疫组和对照组，两大组又分为相等的若干小组。免疫组动物均用同一剂量接种，免疫经过一定时间后，与对照组同时用不同稀释倍数强毒攻击，比较免疫组与对照组的存活率和死亡率。效力检验例：狂犬病疫苗对照组攻击10-5稀释毒有50%动物死亡，而免疫组动物攻击10-3稀释度强毒有50%死亡。即免疫组对强毒的耐受力比对照组高100倍。即免疫组有100个LD50的保护力。效力检验③变量免疫定量攻击法将疫苗作不同稀释度并各免疫一定数量动物，经2-3周建立免疫后，各免疫组动物连同对照动物用用同一剂量强毒攻击，观察一定时间后统计存活和死亡数，用统计学方法计算能使50%的动物得到保护的免疫剂量。效力检验例：鸡新城疫油乳剂灭活苗选择3-4周龄敏感鸡35只，以1／25、1／50、1／100倍稀释疫苗——各皮下或肌肉注射10只鸡，每只0.5ml——另5只不免疫为对照。3-4周后，每只鸡肌肉注射105EID50的新城疫强毒，观察14天，按每组死亡数，对照组全死的结果计算出50%保护量（PD50）要求：该苗每一个使用剂量（0.5ml）的效价不低于50个PD50。效力检验④抗病血清的抗体效价测定将抗病血清注射易感动物，经一定时间（一般1-3天）用相应的强毒攻击，观察血清抗体被动免疫所引起的保护作用。效力检验例：抗炭疽血清12只豚鼠——分3组，每组4只——二组分别注射0.5ml和1.0ml——24小时后，连同不注射血清的对照豚鼠4只全部攻击致死剂量的芽孢液——如对照组7天内全部死亡，两免疫组存活6只以上，或对照组死亡3／4，免疫组全部健活时，血清为合格。效力检验(2)活菌计数与病毒量的滴定①活菌计数②病毒量滴定用细胞培养生产的疫苗多采用蚀斑计数、半数细胞感染量测定病毒量。效力检验(3)血清学试验主要用于诊断制品的检验。检验方法有凝集试验、沉淀试验、中和试验、补体结合试验等。例：用凝集试验检验布鲁氏菌虎红平板凝集抗原和阳性血清的效价。真空度检验冻干制品在入冷库保存时和出厂前两个月应由质检部门检测真空度。无真空的制品，应予以报废，不得重抽真空。真空度检验1.仪器对于用玻璃容器盛装的真空冻干制品，目前采用高频火花真空测定器进行测定。它能在容器外边测量容器内部的真空度。适用于采用真空密封、并用玻璃容器盛装的冻干疫苗。真空度检验2.原理利用忒斯拉线圈的高频交变电场，电子倒转使气体分子电离而产生所谓无极放电现象，根据稀薄气体空气的放电颜色能粗略地估计出容器内真空度的高低。真空度检验3.方法在通电状态下，把线圈的尖端靠近疫苗玻璃瓶，观察瓶内的放电状态。常压下即完全失真空，不产生放电现象。随着真空度的提高，瓶内呈现出从桃红到蓝白的放电，在具有换气装置的暗室内进行操作就容易判断放电的颜色，放电颜色因玻璃瓶内气体的种类而异。真空度检验4.结果判定《兽用生物制品规程》规定，对于采用真空密封，并用玻璃容器盛装的冻干制品，使用高频火花真空测定器进行密封后容器内真空度的测定，如果容器内出现白色、粉色和紫色辉光的均属真空度合格。真空度检验5.注意事项检测时需要注意的是，放电火花探头端要离开玻璃外壁1cm左右，间歇放电。不能长时间停在一处放电，也不能与瓶子封口处金属铝盖接触，以免击穿玻璃造成失真空。亦不应指向容器内的制品部分放电，以免损伤产品。另外刚从冷冻室取出的疫苗应在4℃或室温放置片刻再测，也可振摇几次然后再测，这样可以激活瓶内极少量的空气分子，更准确地判断疫苗的真空状况。质量检验兽医生物制品的质量检验是兽医