浅论EvaGreen-染料法实时定量PCR检测急性髓系白血病PRAME基因转录本

浅论EvaGreen染料法实时定量PCR检测急性髓系白血病PRAME基因转录本【摘要】目的：采用实时定量聚合酶链反应(RQPCR)法检测急性髓系白血病(AML)中黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)基因转录本，初步评价其在AML中的临床意义。方法：设计PRAME基因引物，建立扩增PRAME基因转录本的EvaGreen染料法RQPCR法，对PRAME转录本克隆质粒进行扩增，评价其特异性、重复性和灵敏性。并对10例AML患者的骨髓单个核细胞标本进行初步检测。结果：所建立的EvaGreenRQPCR法具有良好的特异性，最低可检测到10个拷贝/μl的阳性模板，但其重复性差，而108～102拷贝/μl阳模的重复性良好。10例初诊AML患者PRAME转录本绝对含量为×102～×105拷贝/50ng(中位×103拷贝/50ng)，ABL标化后的相对含量为%～13%(中位%)。而对照组8例缺铁性贫血患者中PRAME转录本相对含量为%～%(中位0)。1例AML患者诱导缓解后PRAME转录本下降，复发时又明显升高。结论：EvaGreen染料法RQPCR检测PRAME转录本方法敏感可靠，可用于AML患者临床监测。

【关键词】实时定量PCR;EvaGreen染料;PRAME基因;急性髓系白血病

[Abstract]Objective:Toevaluatethemethodofrealtimequantitativepolymerasechainreaction(RQPCR)withEvaGreendyefordetectingthepreferentiallyexpressedantigenofmelanoma(PRAME)transcriptsinpatientswithacutemyeloidleukemia(AML).ToinvestigatepreliminarilythecharacteristicsandclinicalimplicationofPRAMEtranscriptsin：TheprimersofPRAMEtranscriptweredesigned.TheconditionofRQPCRwithEvaGreenwasestablishedtodetectPRAMEandABLpositivetemplates.Toevaluatetheutilityofthisassay,thesamplesofbonemarrowmononuclearcellsfrom10patientswithAMLweredetected.Results：TherewasagoodspecificityintheEvaGreenRQPCR.Inrepeatedtests,maximalsensitivitiesof10copies/μlwereobtained,whilereproduciblemaximalsensitivitiesachieved100copies/μl.ThemedianabsoluteandnormalizedamountofPRAMEtranscriptswere×103(×102～×105)copies/50ngand%(%～13%)respectively.InoneAMLcase,thePRAMEtranscriptlevelsignificantlydecreasedafterinductiontherapycomparedtothemomentofdiagnosis,butsignificantlyincreasedafterrelapse.Inthecontrolgroup,consistingofeightsamplesfrompatientswithirondeficientanemia,thenormalizedPRAMEtranscriptlevelwas%～%(median0).Conclusion：EvaGreenRQPCRforPRAMEtranscriptwasasensitive,reliablequantitativeassayandcanbeusedinthediagnosisofAMLandthediseasefollowup.

[Keywords]realtimequantitativePCR;EvaGreendye;PRAMEgene;acutemyeloidleukemia

黑色素瘤优先表达抗原(preferentiallyexpressedantigenofmelanoma，PRAME)最初是Iked等从黑色素瘤中分离出来的一种肿瘤相关抗原，能被细胞毒性T细胞(cytotoxicTlyphocyte,CTL)识别[1]。PRAME基因位于染色体22q11，编码509个氨基酸的蛋白质，在除睾丸以外的正常组织中不表达或低水平表达,在包括白血病在内的多种肿瘤细胞中高度表达,其表达水平随病情变化趋势与白血病的特异性分子标志相一致，可考虑将PRAME基因作为一种白血病病情动态监测的分子标志，用于评价微小残留病(minimalresidualdisease，MRD)[3，4]。我们建立了荧光染料EvaGreenRQPCR法检测PRAME基因转录本并对其进行评价，证实EvaGreenRQPCR具有良好的特异性、重复性、敏感性，可用于批量标本的检测。

1资料与方法

病例资料

10例初诊AML均为本院血液科住院患者，诊断按《血液病诊断及疗效标准》，其中M12例、M23例、M31例、M42例、M52例;对照组为8例缺铁性贫血(IDA)患者。

方法

细胞分离和RNA提取全部患者均于初诊时抽取骨髓10ml，肝素抗凝，用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞(MNC)，应用Trizol一步法提取总RNA，经紫外分光光度仪定量，保存在-80℃备用。

逆转录将μg总RNA应用六随机引物逆转录合成第一链cDNA，总体系40μl，含MMLV逆转录酶200U﹑dNTP(每种mmol/L)，10mmol/LDTT，RNAsin25μl，37℃逆转录1h，95℃5min灭活，cDNA保存于-20℃备用。

定性PCR扩增扩增根据文献合成PRAME基因引物，序列分别为5′TTTCCCCGGAGAAGGAG3′(上游引物)，5′CGAAAGCCGGCAGTTAGTTA3′(下游引物)，扩增片段为179bp;应用看家基因ABL作为内参照，其上游引物为5′TCCTCCAGCTGTTATCTGGAAGA3′，下游引物为5′TCCAACGAGCGGCTTCAC3′，引物于上海基康生物技术公司合成。25μl反应体系含cDNA100ng，mmol/LdNTPμl，Taq酶U，10×缓冲液μl，10pmol引物μl。反应条件为95℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，共35个循环，最后72℃7min。PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

阳性模板制备将1例AML患者的PRAME定性PCR扩增产物克隆入PGEMT载体，扩增纯化重组载体、测序鉴定(上海基康)，并将其定量。最后从108拷贝/μl开始进行10倍稀释，建立阳性模板梯度，4℃储存备用。

EvaGreenRQPCR引物序列同定性PCR。25μl反应体系包含cDNA50ng，mmol/LdNTPμl，MgCl2μl，10pmol/μl引物μl，20×EvaGreen(BIOTIUM公司)μl，50×ROXμl，Taq酶U(MBI公司)。扩增在PE7300(美国ABI公司)扩增仪上进行。反应条件为94℃4min，然后94℃30s，62℃30s，72℃30s，82℃30s，共50个循环，于82℃收集荧光。熔解曲线程序为95℃15s，60℃60s，95℃15s，60℃15s。PRAME转录本的绝对量表示为每50ng总RNA中含有的拷贝数，而每个患者中PRAME表达的值则以相对定量表示(NPRAME=PRAME转录本拷贝数/ABL转录本拷贝数×100%)。

统计学处理

应用软件包计算中位数、变异系数;AML与IDA患者PRAME基因转录本差异应用MannWhitneyU检验，设定P值为双侧分布，以为差异有统计学意义。

2结果

EvaGreenRQPCR灵敏度、重复性、特异性和扩增效率

PRAME质粒经测序结果与基因库序列符合(NM_006115)。对不同浓度PRAME质粒和ABL质粒分别扩增6次，最大灵敏度都能达到10拷贝/μl，但其重复性不好，6次扩增PRAME质粒2次为阴性，ABL质粒3次为阴性;而108～102拷贝/μl的重复性良好(表1)。模板与CT值的相关性分别为6和1，标准曲线的斜率(slope)分别为6和31，PCR扩增效率(=10-1/slope)分别为287和997。6次无模板对照(NTC)均无扩增信号。图1为PRAME基因的荧光扩增曲线和标准曲线。表1不同浓度PRAME和ABL基因扩增6次的变异系数

EvaGreenRQPCR检测AML患者PRAME基因表达

如待测标本的CT值比最大稀释度阳模的CT值加4个循环数小，则将PRAME判定为阳性，反之，如待查标本的CT值比最大稀释度阳模的CT值加4个循环数大，则判定为阴性，如无EvaGreenRQPCR扩增也认为结果为阴性。10例初诊AML患者中PRAME转录本的检测结果均为阳性，其CT值介于～之间，绝对数量为×102～×105(中位×103)拷贝/50ng，NPRAME为%～13%(中位%)。而8例对照中PRAME转录本量为0～(中位)拷贝/50ng，NPRAME为%～%(中位%)。AML患者与IDA患者之间PRAME转录本水平的差异具有统计学意义(P=)。

1例AML患者的动态监测结果

对1例患者的冻存随访标本进行检测，其在病程中PRAME拷贝数变化见图2。初发时达到%，经治疗达到第1次完全缓解(CR)后降至%，月后复发时再次增高达%，再次诱导化疗达CR2后又降至%。

3讨论

大量研究已经表明MRD监测对于白血病患者预后判断和分层治疗具有重要的指导意义，应用RQPCR监测白血病特异性融合基因是目前监测白血病MRD的主要手段之一。但AML患者中特异性融合基因发生率仅为30%～50%，其中较为常见的AML1/ETO，PML/RARα，CBFβ/MYH11等则仅为20%左右。寻找

[1]IkedaH,LethéB,LehmannF,etal.CharacterizationofanantigenthatisrecognizedonamelanomashowingpartialHLAlossbyCTLexpressinganNKinhibitoryreceptor[J].Immunity,1997,6(2):199-208.

GreinerJ,RinghofferM,TaniguchiM,etal.mRNAexpressionofleukemiaassociatedantigensinpatientswithacutemyeloidleukemiaforthedevelopmentofspecificimmunotherapies[J].IntJCancer,2004,108(5):704-711.

TajeddineN,MillardI,GaillyP,etal.RealtimeRTPCRquantificationofPRAMEgeneexpressionformonitoringminimalresidualdiseaseinacutemyeloblasticleukaemia[J].ClinChemLabMed,2006,44(5):548-555.

QinY,ZhuH,JiangB,etal.ExpressionpatternsofWT1andPRAMEinacutemyeloidleukemiapatientsandtheirusefulnessformonitoringminimalresidualdisease[J].LeukRes,2009,33(3):384-39.

张之南.血液病诊断及疗效标准[M].2版.北京：科学出版社,1998:219-228.

SchenkT,StengelS,GoellnerS,etal.HypomethylationofPRAMEisresponsibleforitsaberrantoverexpressioninhumanmalignancies[J].GenesChromosomesCancer,2007,46(9):796-804.

vanderVeldenVH,HochhausA,CazzanigaG,etal.Detectionofminimalresidualdiseaseinhemat