培养基灭菌空气灭菌

第一节培养基灭菌灭菌的概念灭菌的方法湿热灭菌的原理分批灭菌设计连续灭菌设计微生物的热死动力学当前第1页\共有71页\编于星期三\22点灭菌的概念消毒（disinfection）与灭菌（sterilization）的区别？杀灭所有微生物杀灭病源微生物当前第2页\共有71页\编于星期三\22点灭菌的概念消毒是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。例如，巴氏消毒法，是将物料加热至60℃维持30min，以杀死不耐高温的微生物营养细胞。灭菌是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的。当前第3页\共有71页\编于星期三\22点高温瞬间巴氏消毒法的操作流程图法国微生物学家、化学家、近代微生物学的奠基人。当前第4页\共有71页\编于星期三\22点灭菌的概念防腐就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。（1）低温（4）高渗（2）缺氧（5）高酸度（3）干燥（6）防腐剂防腐（antisepsis）当前第5页\共有71页\编于星期三\22点灭菌的方法化学药物灭菌射线灭菌空气的过滤除菌加热灭菌当前第6页\共有71页\编于星期三\22点化学灭菌法甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等适用范围：环境、皮肤及器械的表面消毒当前第7页\共有71页\编于星期三\22点射线灭菌电磁波、紫外线或放射性物质适用范围：无菌室、接种箱微波辐射灭菌紫外线波长200-300nm的紫外线具有杀菌作用。作用于DNA，使一条DNA链上相邻的两个胸腺嘧啶共价结合形成二聚体，导致细菌变异和死亡。电离辐射高速电子、X射线、γ射线微波波长1mm~1m当前第8页\共有71页\编于星期三\22点过滤除菌法利用过滤方法阻留微生物适用范围：制备无菌空气当前第9页\共有71页\编于星期三\22点固定滤膜装置当前第10页\共有71页\编于星期三\22点加热灭菌法湿热灭菌法(高压蒸汽)

利用饱和蒸汽灭菌，条件：121℃，30min

适用范围：生产设备及培养基灭菌干热灭菌法常用烘箱，灭菌条件：160℃下保温1h

适用范围：金属或玻璃器皿火焰灭菌法火焰适用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口

当前第11页\共有71页\编于星期三\22点湿热灭菌

湿热灭菌原理：蒸汽具有很强的穿透能力，在冷凝时会放出大量的冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。

灭菌条件：121℃，30min灭菌不利方面：同时会破坏培养基中的营养成分，甚至产生不利于菌体生长的物质。当前第12页\共有71页\编于星期三\22点关于灭菌和消毒的不正确的理解是（）A．灭菌是指杀灭环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子B．消毒和灭菌实质上是相同的C．接种环用灼烧法灭菌D．常用灭菌的方法有加热法、过滤法、紫外线法、化学药品法当前第13页\共有71页\编于星期三\22点谷氨酸棒状杆菌的培养液常采用的灭菌方法是（）A．高压蒸汽灭菌B．高温灭菌C．加入抗生素灭菌D．酒精灭菌当前第14页\共有71页\编于星期三\22点分批灭菌（间歇灭菌）将配制好的培养基同时放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，也称实罐灭菌。过程包括：升温、保温和冷却三阶段。各阶段对灭菌的贡献：20%、75%、5%。当前第15页\共有71页\编于星期三\22点连续灭菌将培养基在发酵罐外通过连续灭菌装置进行加热、保温和冷却而进行灭菌。问题连续灭菌的基本设备有哪些？发酵罐蒸汽蒸汽冷却水无菌培养基配料罐泵连消塔维持罐冷却管当前第16页\共有71页\编于星期三\22点连续灭菌（1）配料预热罐，将配制好的料液预热到6070℃，以免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声；（2）连消塔，用高温蒸汽使料液温度很快升高到灭菌温度（126132℃）；发酵罐蒸汽蒸汽冷却水无菌培养基配料罐泵连消塔维持罐冷却管当前第17页\共有71页\编于星期三\22点连续灭菌（3）维持罐，使料液在灭菌温度下保持57min。因为：连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的；（4）冷却管，使料液冷却到4050℃后（冷水喷淋），输送到预先灭菌过的罐内。

发酵罐蒸汽蒸汽冷却水无菌培养基配料罐泵连消塔维持罐冷却管当前第18页\共有71页\编于星期三\22点连续灭菌当前第19页\共有71页\编于星期三\22点连续灭菌当前第20页\共有71页\编于星期三\22点连续灭菌连续灭菌过程中温度的变化(虚线)当前第21页\共有71页\编于星期三\22点间歇灭菌与连续灭菌的比较当前第22页\共有71页\编于星期三\22点微生物的热死动力学微生物受热死亡的主要原因是高热能使蛋白质变性，这种反应可认为是单分子反应，死亡速率可视为一级反应，即与残存的微生物数量成正比。当前第23页\共有71页\编于星期三\22点微生物的热死动力学式中N－经时间t后残存的活菌浓度（个/L)，N0—开始灭菌时原有活菌浓度（个/L)；t－灭菌时间（s,min）K－比热死速率常数、灭菌速率常数或比死亡速率常数（s-1,min-1）它的大小与微生物的种类和加热温度有关。在同等温度下，其值小，微生物的耐热性强。从上式得出：t与N之间的关系为对数式中N/N0,菌体存活率，而N0/N，为灭菌度。当前第24页\共有71页\编于星期三\22点微生物的热死动力学实验证明，细菌孢子的热死灭动力学与营养体细胞显著不同。对于耐热性的微生物芽孢，存在“菌体循序死亡模型”假说，认为：芽孢的死亡是渐进的。有耐热的芽孢（R型）转变为死亡的芽孢（D型），需经过敏感的中间过程（S型）。当温度超过120℃时，热阻极强的芽孢与营养体的热死灭动力学基本符合一级反应动力学规律。当前第25页\共有71页\编于星期三\22点微生物的热死动力学

T对K的影响式中：A——频率因子，7.94×1038，min-1ΔE——活化能，J/molR——通用气体常数，8.28J/（mol·K）在相同条件下，ΔE越高，K值越低，热死速率越慢。不同菌的孢子的热死灭反应ΔE各不相同，且K值取决于ΔE和T。对上式取对数，得当前第26页\共有71页\编于星期三\22点微生物的热死动力学K是ΔE和T的函数反应的ΔE越高，lnK对T的变化率越高，即T的变化对K的影响越大。迅速提高灭菌温度，可加快细菌孢子的死灭速度，缩短在高温下的灭菌时间，而灭菌对于培养基中有效成分的破坏大为减少。高温短时间灭菌——灭菌动力学得出的最重要结论当前第27页\共有71页\编于星期三\22点例1：当杀菌温度从120℃升至150℃，试计算维生素B1的分解速率常数KB和嗜热脂肪芽孢杆菌的死亡速率常数KS。已知⊿ES=283460J/mol,As=1.06×1036(min-1)；⊿EB=92114J/mol,AB=1.06×1010(min-1)

解：由（1）式，即㏑K=㏑A－(⊿E/RT)得

lnKs=lnAs－⊿ES/(RT)

∴Ks在120℃时为0.0156(min-1)

150℃时为7.54(min-1)灭菌速率常数提高482倍。

同样地：KB在120℃时为0.00535(min-1)，150℃时为0.040(min-1)，同样的温度变化仅提高6.5倍。

当前第28页\共有71页\编于星期三\22点例2：将10000千克的培养基在发酵罐内进行分批灭菌，灭菌温度为120℃，灭菌后要求每1000批中只有一个杂菌，培养基原始污染度为105个/g，试计算总杀菌效率V总。解：N=10-3

即，V总=34.5当前第29页\共有71页\编于星期三\22点例3：发酵培养基60m3，杂菌活孢子浓度105/mL，要求灭菌后残存孢子数N为10-3个。设计的T-t过程如下，是否达到灭菌要求？（A=7.94×1038min-1，△E=287441J/mol，R=8.28J/(mol·K)）解：由可得各个K值根据题意，灭菌要求即为，当前第30页\共有71页\编于星期三\22点从得出的K值可以看出，在100℃以下灭菌，对细菌孢子的杀灭几乎是无效的，因为从灭菌开始的前36min和63min以后，K值几乎可以忽略不计。在整个灭菌过程只有30min是有效的。当前第31页\共有71页\编于星期三\22点---K-t图，---T-t图当前第32页\共有71页\编于星期三\22点将有效灭菌时间，即34min至64min的图解积分值为33.8---K-t图，---T-t图由图可得，T-t的关系为，T=-2.5357t2因此，T-t的趋势线故，设计的T-t过程不能达到灭菌要求。当前第33页\共有71页\编于星期三\22点1.杀灭芽胞最常用和最有效的方法是：____________。

a.紫外线照射b.煮沸5minc.巴氏消毒法

d.高压蒸气灭菌法

2.下述不可能杀灭细菌芽胞的方法是：____________。

a.煮沸法b.巴氏消毒法c.间歇灭菌法d.干热灭菌法

e.高压蒸气灭菌法

3.常用于空气或物体表面的消毒____________。

a.高压蒸气灭菌法b.紫外线照射法

c.滤过除菌法d.巴氏消毒法

4.常用于基础培养基灭菌____________。

a.高压蒸气灭菌法b.紫外线照射法c.滤过除菌法

d.巴氏消毒法

当前第34页\共有71页\编于星期三\22点第二节空气除菌空气除菌的引入空气中的微生物空气除菌方法空气过滤设计膜过滤器空气除菌典型流程当前第35页\共有71页\编于星期三\22点空气除菌的引入微生物发酵分好氧发酵和厌氧发酵两类。无菌空气是好氧微生物的氧源。空气过滤失败占发酵染菌各种因素的20%左右。空气过滤器的作用是防止空气把杂菌带入发酵过程，保证发酵从接种到放罐的整个过程为纯种培养，不受外源微生物的污染。当前第36页\共有71页\编于星期三\22点空气除菌的引入在普通城市郊区，在干燥、晴朗的天气条件下，空气中微生物数目为102~104个/m3；好氧发酵的平均通气量为0.8vvm（每分钟每体积发酵液需要空气体积）；次级代谢产品的发酵需要200h；一个100m3的发酵罐；在整个发酵过程中所需通入空气中的微生物的量为1亿~100亿个。当前第37页\共有71页\编于星期三\22点空气中的微生物空气中悬浮着大量的微生物，它们附着在空气中的灰尘及颗粒或水珠上。这些微生物包括霉菌、细菌、放线菌、酵母及噬菌体等。城市空气中微生物的密度较高，农村和山区较低，夏季比冬季多，气候温和潮湿的地区，空气中微生物比较多，工厂附近以主风向上游密度较低。高度每升高2.5m，空气中的尘埃粒子含量下降一个数量级，因此高空取气很重要。当前第38页\共有71页\编于星期三\22点空气除菌方法无菌空气是指自然界的空气通过除菌处理使其含量降低到一个极限百分数的净化空气。获取方法利用加热、化学药剂或射线：蛋白质变性利用过滤介质及静电除尘捕集空气中的灰尘及颗粒当前第39页\共有71页\编于星期三\22点空气除菌方法加热灭菌原理：微生物在高温下容易被杀死；利用空气被压缩时产生的热来灭菌。特点：空气传热效率低，温度分布不均匀，灭菌时间长；不适合大量制造无菌空气。当前第40页\共有71页\编于星期三\22点空气除菌方法辐射灭菌原理：波长在226.5~328.7nm的紫外线对空气中微生物的杀菌效力最强。声波、高能阴极射线及γ射线都可用于空气灭菌。特点：灭菌时间长；大规模应用不经济；该法用于无菌室、接种间。当前第41页\共有71页\编于星期三\22点空气除菌方法化学灭菌常用的空气灭菌用化学药剂有苯酚、环氧乙烷、过氧化氢、重金属盐、新洁尔灭、甲醛溶液和硫磺等。原理：将杀菌剂溶于水配成合适的浓度，使空气在杀菌剂溶剂中通过或喷洒于空气中以杀死空气中的微生物。特点：除菌结束后必须除去夹带杀菌剂的水汽和雾。应用于无菌室、接种间和培养间的灭菌。当前第42页\共有71页\编于星期三\22点空气除菌方法静电除尘原理：使空气中的灰尘成为载电体，然后将其捕集在电极上。热点：能量消耗少设备庞大空气最好为无油，湿度低当前第43页\共有71页\编于星期三\22点空气除菌方法介质过滤发酵工业用于发酵罐制备无菌空气的方法是介质过滤。使用的过滤介质有棉花、玻璃纤维、不锈钢纤维、聚丙烯纤维。目前在发酵工业上普遍采用的是膜过滤器。当前第44页\共有71页\编于星期三\22点空气过滤设计采用概率论进行分析空气过滤，基本假设有三点：纤维填充的空气过滤器由多层介质组成；微生物经过每一层玻璃纤维时，与玻璃纤维碰撞存在一定概率；当微生物与纤维碰撞次数小于一定值时，仍能通过过滤器中流出而返回空气中。滤层厚度越大，空气通过过滤介质的时间越长，捕集效率也就越大；纤维直径越小，捕集效率也越大。捕集效率当前第45页\共有71页\编于星期三\22点空气过滤设计空气过滤器除菌机制直接截留惯性冲击布朗运动或扩散拦截重力沉降静电吸引当前第46页\共有71页\编于星期三\22点空气过滤设计空气过滤器除菌机制直接截留空气流线中所夹带的微粒由于和纤维相接触而被捕集时称为直接截留。过滤介质起筛网的作用机械截留颗粒。直接截留的截留效率完全决定于颗粒直径。当前第47页\共有71页\编于星期三\22点空气过滤设计空气过滤器除菌机制2.

惯性冲击颗粒以一定速度向纤维垂直运动时，空气受阻改变流向，绕过纤维前进，微粒因惯性作用不能及时改变方向，便冲向纤维表面并滞留下来。在较低流速范围内，冲击过滤效率随气流速度增加而降低；增至临界流速时，效率随气流速度增加而提高；当气流速度再上升，效率会显著下降。当前第48页\共有71页\编于星期三\22点空气过滤设计空气过滤器除菌机制3.

布朗运动或扩散拦截微小的颗粒受空气分子碰撞发生布朗运动。颗粒与介质相碰而被捕集成为扩散。纤维直径越小，气流运动速度越小，扩散捕集效率越高。当前第49页\共有71页\编于星期三\22点空气过滤设计对数穿透定律设N1为过滤前空气中的总颗粒数，N2为过滤后空气中的颗粒数，则穿透率为：则除菌效率为：对数穿透定律假定空气过滤时其中的颗粒数随通过滤层厚度的增加而均匀递减。当前第50页\共有71页\编于星期三\22点空气过滤设计对数穿透定律取滤层厚度中某一微长度dL，在此长度中颗粒的减少数dN可表示为：式中：N——空气中的颗粒数，个L——滤层厚度，cm

K’——除菌常数，m-1当前第51页\共有71页\编于星期三\22点空气过滤设计对数穿透定律积分：得出对数穿透率为：或K值的大小与空气流速、纤维的填充密度和直径、空气中的颗粒大小等因素有关，可通过计算求得。当前第52页\共有71页\编于星期三\22点空气过滤设计对数穿透定律η为90%时的过滤厚度作为基准，即即代入得当前第53页\共有71页\编于星期三\22点空气过滤设计对数穿透定律即或常数K为过滤效率为90%时得到的L90的数据，即当前第54页\共有71页\编于星期三\22点膜过滤器发酵工业初期采用棉花作为介质逐渐被玻璃纤维、不锈钢纤维和聚丙烯纤维代替目前都被膜过滤器取代预过滤器和可蒸汽灭菌的无菌过滤器当前第55页\共有71页\编于星期三\22点膜过滤器预过滤器作用：除去空气中的颗粒和尘埃以及液珠。分类：除去颗粒的预过滤器、除去液体雾滴的预过滤器。安装位置：在可灭菌过滤器的上游当前第56页\共有71页\编于星期三\22点膜过滤器可灭菌的无菌膜过滤器膜片由多孔的疏水有机材料制成，最常用的是聚偏氟乙烯和聚四氟乙烯。无菌膜过滤器主要指膜孔为0.22um以下的膜过滤器。当前第57页\共有71页\编于星期三\22点空气除菌典型流程空气空压机贮气罐冷却除油水加热空气预处理总过滤器分过滤器无菌空气

空气过滤当前第58页\共有71页\编于星期三\22点空气除菌典型流程空气预处理目的:提高压缩前空气的洁净度（1）提高空气吸气口的位置；（2）在空气入口处设置粗过滤器——捕集较大的灰尘颗粒，并保护空压机。去除压缩后空气中的油和水当前第59页\共有71页\编于星期三\22点空气除菌典型流程空气预处理当前第60页\共有71页\编于星期三\22点空气除菌典型流程空气压缩和压缩空气的冷却（1）空气压缩：克服输送过程中过滤介质的阻力并维持一定的气流速度。（2）压缩后空气温度显著上升，需冷却。压缩后的高温空气能引起过滤介质的炭化或燃烧增大发酵罐的降温负荷增加培养液水分的蒸发，一般用列管式冷却器冷却。当前第61页\共有71页\编于星期三\22点空气除菌典型流程空气压缩和压缩空气的冷却当前第62页\共有71页\编于星期三\22点空气除菌典型流程空气贮罐消除压缩机排出空气量的脉冲，维持稳定的空气压力。利用重力沉降作用除去部分油雾。紧接空压机安装。有些装有冷却管。当前第63页\共有71页\编于星期三\22点空气除菌典型流程压缩空气的除油除水冷却降温后的空气湿度增大，会使过滤介质受潮失效。两类设备旋风分离器——利用离心力进行沉降，对于10m以上的微粒分离效率较高。丝网分离器——利用惯性进行拦截，分离效率较高，能除去2～5m的细小颗粒。当前第64页\共有71页\编于星期三\22点空气除菌典型流程压缩空气的除油除水当前第65页\共有71页\编于星期三\22点空气除菌典型流程压缩空气的除油除水采用惯性拦截等机理，有效去除空气中的水、油雾、尘埃，不锈钢丝网可清洗，使用