检验用色谱柱、流动相管理规程

Number/Version:MQC0011-01Title:ChromatographicColumnAndMobilePhaseManagementProcedure检验用色谱柱、流动相管理规程Effective：制订/日期QC/主管审核/日期QC/部长批准/日期质量副总经理分发部门：质保部（QA）、质控部（QC）修订历史：版本号 修订日期 修订概述01 2020.07.02 首次制订Page1of8Number/Version:MQC0011-01Title:ChromatographicColumnAndMobilePhaseManagementProcedure检验用色谱柱、流动相管理规程Effective：1.0目的本规程用于规范实验室分析检测用色谱柱、流动相的管理，保证检验质量。2.0范围适用于公司分析检测用色谱柱、流动相的管理。3.0职责本文件由质控部（QC）负责起草，质控部（QC）部长审核，质量副总经理批准；质控部（QC）负责本规程的贯彻实施，质保部（QA）负责监督检查本规程的执行。参考文件《中国药品GMP指南》2010版。定义N/A规程色谱柱的管理色谱柱的编号为便于追踪和统一管理，为采购的每根色谱柱制定相应的唯一编号，具体编制规则如下：XX-XX-XX工 两位流水序号，为该色谱柱当年购进时的流水顺序编号 两位年份色谱柱分类代码（LC液相色谱柱，GC气相色谱柱，QT其他色谱柱）如：LC-12-06表示2012年流水序号为06的液相色谱柱。新购进的色谱柱应造册登记，登记内容包括：色谱柱编号、来源、品名、型号、规格、柱内保护溶液、购进日期、启用日期、停用日期及原因等。色谱柱应分类存放，盒上贴上标签，注明类别。每启用一根色谱柱，在色谱柱上贴上标签，注明编号、启用日期。液相色谱柱一般按填料不同分为无键合硅胶柱、正相键合色谱柱（如：氨基柱Amino/NH2、氟基柱Cyano/CN/Nitrile）、反相键合色谱柱（如：碳十八柱ODS/C18、碳八柱MOS/C8、碳六柱Hexyl/C6、碳四柱Butyl/C4、碳一柱Methyl/C1、苯基柱Phenyl）以及离子交换柱（如：阴离子交换柱SAX、阳离子交换柱SCX）和凝胶色谱柱等等；气相色谱柱按柱子内径大小可分为填充柱（一般用不锈钢管）和毛细管柱（玻璃或石英毛细管）。每根柱子每两个月保养一次并做好保养记录，特别是对于一些使用频率少的柱子，因为放置时间长，容易干柱。对于确已失效的柱子，需贴上停用标签做好停用记录，并专门存放不能随意丢弃，留待统一处理。对于价格比较昂贵用于成品检验的柱子，由于使用时间较长柱效降低后若性能仍Page2of8Number/Version:MQC0011-01Title:ChromatographicColumnAndMobilePhaseManagementProcedure检验用色谱柱、流动相管理规程Effective：可满足中间体控制检测，则可降级用于检测产品的中间体，但应在柱子标签上注明仅用于中间体检测。色谱柱应有使用、维护保养记录，记录内容包括：色谱柱的一般信息(色谱柱编号、名称、来源、启用日期、停用日期)、使用日期、使用时间、检测样品及批号、使用状况、维护保养时间、维护保养内容、操作者、备注。液相色谱柱的使用使用前注意事项在使用前，一定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。在反相色谱中，如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂，应先用10%左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下，否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出，堵塞色谱柱。色谱柱使用的流动相中所使用的各种有机溶剂要尽可能使用色谱纯，配流动相的水最好是超纯水或全玻璃器皿的双蒸水。如果将所配得流动相再经过0.45pm的滤膜过滤一次则更好，尤其是含盐的流动相。另外，装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应该定期清洗或更换。以常规硅胶为基质的键合相填料通常的PH值适用范围是2.0-8.0,BDSC18适合于碱性化合物，PH值适用范围为2.0-10.0。当必须要在PH值适用范围的边界条件下使用色谱柱时，每次使用结束后立即用适合于色谱柱储存并与所使用的流动相互溶的溶剂清洗，并完全置换掉原来所使用的流动相。样品也要尽可能清洁，最好使用流动相溶解样品。可选用样品过滤器或样品预处理柱(SPE)对样品进行预处理，除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质；若样品不便处理，可使用保护柱。在用正相色谱法分析样品时，所有的溶剂和样品应严格脱水。使用时注意事项(1)柱子在装卸、更换时，动作要轻，接头拧紧要适度；必须防止较强的机械振动，以免柱床产生空隙；(2)如果仪器用来做常规分析，样品种类有限，但分析次数多，则不妨为每一类常规分析配置一根专用柱，这样有助于延长柱子的寿命；(3)避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓；(4)应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦Page2of8Number/Version:MQC0011-01Title:ChromatographicColumnAndMobilePhaseManagementProcedure检验用色谱柱、流动相管理规程Effective：然。大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2—7.5,尽量不超过该色谱柱的pH范围；(5)如使用柱温控制装置时，应注意在通入流动相后才能升温；(6)一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效；(7)选择使用适宜的流动相，以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一个预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解；(8)避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注人柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一个保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱，可以而且应该经常更换；(9)经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50-75mL。液相色谱柱的保存色谱柱每天实验后的保养在完成分析工作之后，不应立即停机，需及时对色谱分析系统进行冲洗，一般0.5h以上，以除去色谱柱内的杂质，然后置换上对应的储存液。一般色谱柱的储存液无特殊说明，均为评价报告所示的流动相；对于反相色谱柱使用缓冲液或含盐的流动相时，实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入10%的甲醇，防止将柱子的填料冲塌陷。长期保存色谱柱如色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水(含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞)中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上、拧紧，防止溶剂挥发干燥。储存的温度最好是室温。液相色谱柱的保养和再生清洗保护柱(预柱)的使用:对于较昂贵的色谱柱，可以在柱前加一保护柱，防止样品中杂质污染分析柱；对于制备柱，因其进样量大，使用保护柱尤为重要。色谱柱使用一段时间后，常遇到柱子被污染，柱效会有一定程度的下降(比如：色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰的现象)，通过采用适当的方法对色谱柱进行再生处理，可以延长色谱柱的Page2of8Number/Version:MQC0011-01Title:ChromatographicColumnAndMobilePhaseManagementProcedure检验用色谱柱、流动相管理规程Effective：使用寿命。再生处理包括正反两种顺序：依次采用20-30倍的色谱柱体积的下列对应溶剂作为流动相冲洗色谱柱，完成后再以相反顺序冲洗色谱柱。推荐使用常规流速的1/5-1/2,切换流动相时浓度梯度由小到大。以下是一些常见柱子的再生处理程序：（1）硅胶柱（未键合）：正己烷一f二氯甲烷一f异丙醇（2）硅胶基质非极性键合相（C18,C8,C4,C2,C1,Phenyl）：95%水/5%乙腈（甲醇）一f乙腈（甲醇）一fTHF；（含蛋白污染物）B从10%到90%的梯度，A=0.1%TFA水溶液，B=0.1%TFA乙腈溶液（3）硅胶基质极性键合相（CN,NH2,DIOL等）：氯仿一f异丙醇一f二氯甲烷一f庚烷（4）离子交换树脂柱（SCX/SAX等）：一般采用高浓度（1-2mol/L）的NaCl溶液油脂等物质可用低浓度碱溶液（如0.1mol/L的NaOH溶液）冲洗酸性有机物用低pH缓冲液冲洗碱性有机物用高pH缓冲液冲洗，再用蒸馏水一f甲醇一f二氯甲烷冲洗。（5）凝胶色谱柱（GPC/GFC等）：通常用稀的氢氧化钠或非离子型去垢剂冲洗疏水蛋白可用24%或30%乙腈冲洗过夜除去亲水蛋白可用30%-50%乙酸除去痕量胃蛋白酶可用蛋白水解酶处理分解，再用蒸馏水一f甲醇一f蒸馏水冲洗。6.2.5液相色谱柱在使用过程中易出现的问题和解决办法色谱柱在使用中最常见的问题就是柱压升高，如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加，属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高（系统管路堵塞及压力传感器故障除外），一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进人柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。以下列举了部分常见原因及解决办法：（1）色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染；解决方法：如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在10%的稀硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。（2）色谱柱头的填料被样品污染；解决方法：如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。Page2of8Number/Version:MQC0011-01Title:ChromatographicColumnAndMobilePhaseManagementProcedure检验用色谱柱、流动相管理规程Effective：（3）色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出；解决方法：如确定是盐结晶，用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解并置换出来，再换用高浓度甲醇冲洗。（4）流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。解决方法：如果因PH值使用不当造成的，很难恢复。可更换新柱子或联系生产厂家重新装填。气相色谱柱的使用新柱子使用前必须老化每次新安装了气相色谱柱后，都要在进样前进行老化。具体的方法是，先接通载气，然后将柱温从60℃左右以5-10℃/min的速率程序升温到色谱柱的最高使用温度以下30℃（如HP-5柱可到280℃）或者实际分析操作温度以上30℃（如分析时使用240℃，老化温度应270℃），并在高温时恒温30到120分钟，直到记录的基线稳定为止。如果基线难以稳定，可重复进行几次程序升温老化，也可在高温下恒定更长时间。注意：一定要等到基线稳定后，才可做空白运行或进样分析。气相色谱柱在使用一段时间后，柱内会滞留一些高沸点组分，这时基线可能出现波动或出现鬼峰，解决此问题的方法也是老化。暂时不用的气相色谱柱从仪器上卸下后，柱两端应当用一块硅橡胶（可利用废进样隔垫）堵上，并放在相应的包装盒中，以免柱头被污染。每次关机都应将柱箱温度降到50℃以下，然后再关电源和载气。严禁在温度高时就切断载气，这样可能会因为空气（氧气）扩散进入柱管而造成固定液的氧化降解，造成柱效下降甚至报废。严禁使用温度超过柱子最高使用温度。当仪器有过温保护功能时，每次新安装了气相色谱柱都要重新设定保护温度（超过此温度值时，仪器会自动停止加热），以确保柱箱温度不会超过色谱柱的最高使用温度。气相色谱柱的清洗和修理气相色谱柱也有一定的寿命，它与所分析的样品状况和维护情况有直接的关系。柱寿命完结的主要标志是固定液流失太多而失去了分离能力，柱管堵塞和断裂也是导致柱失效的原因。有时只是因为一些高沸点的极性化合物的吸附而使色谱柱丧失分离能力，这时可对其进行清洗和修理。具体办法是先在高温下老化柱子，用载气将污染物冲洗出来；若柱子仍不能恢复，就从仪器上卸下柱子，将柱头截去10cm或更长（柱头是最容易被污染的），再安装上测试。这是常用的柱性能恢复措施。如果还不起作用，可再反复注射溶剂进行清洗，常用的溶剂依次为丙酮、甲苯、Page2of8Number/Version:MQC0011-01Title:ChromatographicColumnAndMobilePhaseManagementProcedure检验用色谱柱、流动相管理规程Effective：乙醇、氯仿和二氯甲苯。每次可进样5-10U1,这一办法常常奏效。如果色谱柱性能还不好，就只有卸下柱子，用二氯甲烷或氯仿冲洗：可用抽真空的方法将溶剂从另一端吸入，也可用对溶剂瓶加压的方法将溶剂压入。溶剂的用量依柱子的污染程度而定，一般20ml左右。如果这一方法仍不起作用，说明色谱柱应该报废了。注意：只有固定液交联的柱子才可以用此法清洗，否则会将固定液全部洗掉，造成柱子报废。流动相的管理流动相的配制液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：（1）流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中（或长时间保留在柱中）。（2）流动相与样品不产生化学反应（3）流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；降低柱压降，延长泵的使用寿命（可运用提高温度的方法降低流动相的黏度）。（4）流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。（5）流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。（6）在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。流动相流速的选择因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml/min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml/min为佳。当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间（如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量）。注意：（1）流动相要求使用0.45间滤膜过滤，除去微粒杂质。（2）使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命