临床血液学检验技术-第五章-第一节-白细胞功能检验-课件

第一章造血及造血调控第一节造血器官与造血微环境临床血液学检验技术第五章白细胞检验技术第一节白细胞功能检验目录

一、粒细胞及单核细胞功能检查

二、粒细胞动力学检验

三、淋巴细胞功能检查第一节白细胞功能检验一、粒细胞及单核细胞功能检查（一）墨汁吞噬试验【实验原理】中性粒细胞及单核细胞对细菌、异物等具有吞噬作用。墨汁吞噬试验(inkphagocytosistest)是在一定量的肝素抗凝血中，加入一定量的墨汁，经37℃温育4小时，涂片染色，镜下观察200个吞噬细胞对墨汁的吞噬情况，并计算吞噬率及吞噬指数。【参考范围】1.成熟中性粒细胞吞噬率74%±15%，吞噬指数126±60；2.成熟单核细胞吞噬率95%±5%，吞噬指数313±86。第一节白细胞功能检验（一）墨汁吞噬试验【临床意义】1.急性单核细胞白血病M5a为弱阳性，M5b吞噬指数明显增高；2.急性粒细胞白血病(M2)、急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性早幼粒细胞白血病(M3)的原始及幼稚细胞多无吞噬能力，吞噬试验为阴性；3.急性粒-单核细胞白血病(M4)呈阳性反应，慢性粒细胞白血病(CML)的成熟中性粒细胞吞噬能力明显减低。【应用评价】该试验方法简单、实用、经济。利用该试验可了解细胞的吞噬能力，从而协助白血病的诊断和鉴别诊断。此法还可以检测吞噬细胞的非特异性吞噬功能。第一节白细胞功能检验

【实验原理】制备白细胞悬液，将待测的中性粒细胞与葡萄球菌混合，37℃温育一定时间后，细菌可被中性粒细胞吞噬。在油镜下观察中性粒细胞吞噬细菌的情况，根据吞噬率和吞噬指数即可反映中性粒细胞的吞噬功能，该试验即细菌吞噬试验。【参考范围】1.吞噬率(％)：健康者为62.8%±1.4%。2.吞噬指数：健康者为1.06±0.05。（二）细菌吞噬试验第一节白细胞功能检验

【临床意义】吞噬率和吞噬指数增高，反映中性粒细胞吞噬异物功能的增强。常见于细菌性感染，对疑有中性粒细胞吞噬功能低下者，有辅助确诊的价值。【应用评价】细菌吞噬试验简单、方便，不需要特殊仪器设备，可了解中性粒细胞的吞噬功能。（二）细菌吞噬试验第一节白细胞功能检验

【实验原理】溶菌酶能水解革兰阳性球菌细胞壁中的乙酰氨基多糖成分，使细胞失去细胞壁而破裂。血清溶菌酶活性试验利用对溶菌酶较敏感的微球菌悬液为作用底物，根据微球菌的溶解程度来检测血清或尿中溶菌酶的活性，主要方法有琼脂平板法、比浊测定法及免疫测定法。【参考范围】比浊法：11.8±2.2mg/L；平板法：20.4±2.7mg/L；免疫测定法：10～40mg/L。第一节白细胞功能检验（三）血清溶菌酶活性试验【临床意义】1.急性单核细胞白血病的血清和尿液溶菌酶含量明显增高；2.急性粒-单核细胞白血病血清溶菌酶含量也明显增高；3.急性粒细胞白血病的血清溶菌酶的含量可正常或增高；4.急性淋巴细胞白血病多数减低，少数正常；5.慢性髓细胞白血病血清溶菌酶含量正常，但急变时下降。【应用评价】该试验通常用琼脂平板法、比浊测定法检测酶的活性，免疫测定法检测酶的量，两者可以结合分析。免疫测定法具有特异、灵敏、准确及可定量等优点。（三）血清溶菌酶活性试验第一节白细胞功能检验【实验原理】采用Boyden小室法又称为滤膜小室法。该方法运用特殊的小盒装置，用一块3~5微米孔径的微孔滤膜将盒分为上下两个小室，在微孔滤膜的一侧放入粒细胞，另一侧放入趋化因子(细菌菌体或其产物、补体C3a、淋巴因子等)，检测粒细胞经滤膜微孔到达趋化因子这一侧的定向移动能力。【参考范围】趋化指数3.0～3.5。【临床意义】趋化功能降低见于Chediak-Higashi综合征、糖尿病、烧伤、新生儿、慢性皮肤粘膜白色念珠菌感染、高IgE综合征等。【应用评价】本试验是体外检测粒细胞和单核-巨噬细胞趋化性强弱的方法。Boyden小室法比琼脂糖法敏感，能检测出纳克（ng）水平的趋化因子活性，且所需时间短、重复性好。第一节白细胞功能检验（四）趋化功能试验【实验原理】

硝基四氮唑蓝(NBT)是一种染料，其水溶液呈淡黄色。中性粒细胞杀菌过程中能量消耗增多，耗氧量也增加，细胞内磷酸己糖旁路代谢增强。NBT被吞入或渗入中性粒细胞后，可接受葡萄糖-6-磷酸在已糖磷酸旁路代谢中NADPH氧化脱下的氢，而被还原成非水溶性的蓝黑色颗粒沉着在胞质内，可在显微镜下观察并计数阳性细胞百分比。【参考范围】

正常成人的阳性细胞数在10%以下。若有10%以上中性粒细胞能还原NBT，即为NBT还原试验阳性；低于10%则为阴性。第一节白细胞功能检验（五）硝基四氮唑蓝还原试验（五）硝基四氮唑蓝还原试验【临床意义】儿童慢性肉芽肿、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、髓过氧化物酶缺乏症和Job综合症，NBT还原试验阳性；全身性细菌感染时，病人的NBT还原阳性细胞在10%以上，而病毒感染或其他原因发热的患者则在10%以下；器官移植后发热，若非细菌感染所致，其NBT还原试验阴性，若为阳性，则提示可能有细菌感染。【应用评价】本试验简单、快速、重复性好，但易出现假阳性或假阴性。该方法可用来筛检中性粒细胞吞噬和杀菌功能异常的疾病，也可辅助鉴别细菌性和病毒性感染。第一节白细胞功能检验二、粒细胞动力学检验（一）氚标记脱氧胸苷(3H-TdR)测定【实验原理】3H-TdR是DNA合成的前期物质，可准确而稳定地标记细胞核。在体外培养过程中加入丝裂原植物血凝素(PHA)或特异性抗原刺激后，粒细胞进入有丝分裂期，加入3H-TdR，其可被S期的幼稚粒细胞摄入参与DNA合成，摄入量与DNA合成的量及增殖细胞数成正比，用液体闪烁计数器测定3H-TdR的摄入量，即可判定粒细胞的增殖水平。【参考范围】刺激指数SI＜2。第一节白细胞功能检验【临床意义】给急性白血病患者连续静脉输入3H-TdR，8～10d后观察，若有8%～10%的白血病细胞未被标记，说明这一小部分白血病细胞增殖相当缓慢，提示白血病细胞是一群非同步化增殖的细胞。【应用评价】3H-TdR可选择性地协同进入分化细胞的DNA中，具有高标记和稳定的特点，用于放射自显影非常理想。第一节白细胞功能检验（一）氚标记脱氧胸苷(3H-TdR)测定【实验原理】正常骨髓中粒细胞储备量是外周血中的10～15倍。泼尼松具有刺激骨髓中性粒细胞由储备池向外周血释放的功能。如果受检者的骨髓粒细胞储备池正常，服用泼尼松后经过一定时间，中性粒细胞由储备池大量释放至外周血而使外周血中性粒细胞的绝对值明显增高。反之，则无此作用或作用不明显。【参考范围】服药后中性粒细胞最高绝对值＞20×109/L(服药后5h为中性粒细胞上升到高峰的时间)。第一节白细胞功能检验（二）泼尼松刺激试验【临床意义】泼尼松试验可反应骨髓中性粒细胞储备池的容量。中性粒细胞减少患者，如服用泼尼松后外周血中性粒细胞最高绝对值大于20×109/L，表明患者中性粒细胞的储备池正常，粒细胞减少可能是由于骨髓释放障碍或其他因素所致。反之，则反映储备不足。【应用评价】操作方便，结果可靠，能准确反映骨髓中粒细胞的储备。第一节白细胞功能检验（二）泼尼松刺激试验【实验原理】中性粒细胞进入血流后，约半数进入循环池，半数黏附于血管壁成为边缘池粒细胞，此部分粒细胞在外周血白细胞计数中不能得到反映，注射肾上腺素后血管收缩，黏附于血管壁上的粒细胞脱落，从边缘池进入循环池，致外周血白细胞数增高。【参考范围】粒细胞上升值一般低于(1.5～2)×109/L。第一节白细胞功能检验（三）肾上腺素激发试验【临床意义】粒细胞减少者，注射肾上腺素后，如外周血粒细胞较注射前增加1倍以上，或粒细胞上升值超过(1.5～2)×109/L，表示患者粒细胞在血管壁粘附增多，提示病人粒细胞分布异常，即边缘池粒细胞增多，如无脾大，可考虑为“假性”粒细胞减少。如果增高低于上述值，则应进行其他检查，进一步确定粒细胞减少的原因。【应用评价】本方法操作简单，可用于鉴别粒细胞减少症是否为“假性”减少，是粒细胞减少症患者常用的实验检查方法之一第一节白细胞功能检验（三）肾上腺素激发试验【实验原理】利用含有放射性磷的二异丙酯氟磷酸(diisopropylfluorophosphate，DF32P)作为胆碱酯酶的抑制剂，其能与细胞上的胆碱酯酶结合。结合了DF32P的粒细胞崩解后不再与其他细胞相结合。作粒细胞动力学研究时，采血制成标记物后，立即静脉注射DF32P。经过一段时间再次采血，分离粒细胞，追踪观察其放射活性的变化，可测知外周血中有关粒细胞的参数。第一节白细胞功能检验（四）二异丙酯氟磷酸盐标记(DF32P)测定【参考范围】粒细胞总数的测定1.标记粒细胞半衰期(T1/2)：4～10h；血中滞留时间：10～14h。2.全血粒细胞池(totalbloodgranulocytepoolTBGP)：(35～70)×107/kg3.循环粒细胞池(circulationgranulocytepoolCGP)：(20～30)×107/kg4.边缘粒细胞池(marginalgranulocytepoolMGP)：(15～40)×107/kg5.粒细胞周转率(granulocyteturnoverrateGTR)：(60～160)×107/(kg.d)第一节白细胞功能检验（四）二异丙酯氟磷酸盐标记(DF32P)测定【临床意义】在慢性白血病、真性红细胞增多症和骨髓纤维化时，TBGP及GTR显著增加，粒细胞半衰期明显延长。急性粒细胞白血病时粒细胞半衰期有轻微的延长，而再生障碍性贫血时各指数测定值均偏低。【应用评价】

本方法操作繁琐，但结果可靠。可用于体内、体外标记。不能用于标记淋巴细胞。

第一节白细胞功能检验（四）二异丙酯氟磷酸盐标记(DF32P)测定【实验原理】用5-溴脱氧尿嘧啶(5-BrdU)掺入到S期细胞的DNA中，然后用荧光标记的抗5-BrdU的抗体，通过流式细胞仪准确测定细胞的DNA合成速率。【结果】精确测定大量细胞的DNA含量，准确区分G1、S、G2+M细胞周期各时相分布的动态参数，间接了解DNA的合成情况。第一节白细胞功能检验（五）流式细胞仪检测DNA合成【临床意义】可直接用于白血病患者体内细胞增殖的动态研究，据此设计化疗药物的最佳治疗方案；因静止期肿瘤细胞对化疗药物不敏感，而增殖期的细胞则敏感，可将G0期细胞诱导浸润增殖期，再予以药物治疗，以达到最佳杀伤瘤细胞的效果。第一节白细胞功能检验（五）流式细胞仪检测DNA合成【实验原理】细胞在增殖周期的不同阶段，其DNA含量是不同的。荧光染料碘化丙啶可嵌入到死细胞双链DNA和RNA的碱基对中与DNA结合。利用流式细胞仪可将细胞按不同的荧光强度（即反映DNA含量）分类，并绘出DNA直方图，从DNA直方图可以得出在细胞周期中处于不同阶段的细胞所占的百分比。【结果】1.细胞DNA含量细胞中DNA含量用DNA指数（DNAindex,DI）来表示。根据DI值来判断细胞DNA的倍体。2.计算细胞周期各时相比率包括G0/1期、S期和G2+M期。第一节白细胞功能检验（六）流式细胞仪检测DNA含量【临床意义】1.DNA非整倍体细胞是肿瘤细胞的特异性标志从FCM的DNA图形分析可得知血细胞和骨髓细胞DNA的相对含量，从而了解白血病细胞的倍体水平及增殖活动。2.监测白血病化疗后疗效用FCM监测对比化疗后的细胞内DNA含量变化，可迅速得出是否敏感的结论，从而指导临床对初治或复发白血病患者选用和更换化疗方案。3.了解白细胞G0/1期、S期和G2+M期细胞的百分比。白血病患者外周血白血病细胞多处于G0或G1期，S期细胞百分率高者对常用周期特异性药物较为敏感，患者的完全缓解率高，但容易复发；反之则对化疗不敏感，到一旦缓解不宜复发。根据增殖其细胞对周期特异性药物比对静止期细胞为敏感，应用G-CSF来复苏G0期白血病细胞，有利于提高化疗效果。第一节