与细胞衰老与癌变

当前第1页\共有75页\编于星期三\19点5’5’端粒消耗端粒维持细胞衰老细胞永生化染色体DNA端粒端粒当前第2页\共有75页\编于星期三\19点“人体的正常细胞经过有限的分裂次数后即进入衰老阶段，停止增殖而最终走向衰亡。呈恶性生长的癌细胞似乎摆脱了正常衰老过程的约束，在无拘无束地高速生长中获得“永生”。衰老和肿瘤相互对立却又同为人类的“天敌”，两者之间千丝万缕的关联一直以来为人们所关注。近年来端粒酶热点的出现被认为是联结着肿瘤和衰老研究的一条全新纽带，国际权威期刊单元、科学等逐年递增地刊载相关论文和报道，对端粒和端粒酶这一研究方向予以相当关注，认为有可能对肿瘤、衰老等重大生命课题产生深远影响。”当前第3页\共有75页\编于星期三\19点目录端粒的结构与功能端粒酶的结构与功能端粒、端粒酶与细胞衰老端粒、端粒酶与恶性肿瘤当前第4页\共有75页\编于星期三\19点端粒的结构与功能当前第5页\共有75页\编于星期三\19点

二十世纪三十年代，BarbavaMcClintock和HermannJ.Muller发现，染色体的末端有一种能稳定染色体结构和功能的特殊成分。如果缺少了这种成分，染色体之间就会互相粘连、出现结构的变化或其它错误的行为，以致影响到染色体的生存和正确复制并进一步威胁到细胞的存亡。于是从希腊文的"末端"（telos）和"部分"（meros）二词为这种特殊的成分创造了一个全新的术语"端粒"（telomere）。1端粒的发现当前第6页\共有75页\编于星期三\19点断端降解、断端融合、结构功能破坏染色体DNAX射线当前第7页\共有75页\编于星期三\19点从希腊字的末端“telos”和部分“meros”创造了一个全新的单词：端粒——telomere

端粒帽染色体端粒帽当前第8页\共有75页\编于星期三\19点当前第9页\共有75页\编于星期三\19点端粒的精确组成则是在七十年代末才首次被提出。1978年，美国科学家Blackburn发现，单细胞池塘生物四膜虫（Tetrahymena）的端粒是由一种极短的简单重复序列TTGGGG多次重复而成。从那以后，包括动物、植物和微生物在内的多种生物的端粒序列已被确定，它们均是由富含G和T的简单重复序列不断重复而成。2端粒的精确组成当前第10页\共有75页\编于星期三\19点1978年首次发现四膜虫端粒的分子组成：

端粒染色体DNA端粒n（CCCCAA）n（GGGGTT）3’5’（TTGGGG）n（AACCCC）nn（CCCTAA）n（GGGATT）3’5’（TTAGGG）n（AATCCC）n人端粒的分子组成：当前第11页\共有75页\编于星期三\19点端粒帽染色体DNA端粒帽n（CCCCAA）（TTGGGG）nn（GGGGTT）（AACCCC）n3’5’3端粒结合蛋白保护端粒不受核酸酶或化学修饰的作用一般是紧密的非共价键结合当前第12页\共有75页\编于星期三\19点人类纤毛虫类当前第13页\共有75页\编于星期三\19点随着对端粒分子组成结构的阐明，端粒对维护染色体完整性的功能已不是一个笼统的概念。活跃在细胞中枢并当担着延续生命重任的染色体脱氧核糖核酸其实面临的是一个“危机四伏”的境界，它对外要抵御核酸酶等各种因素袭击，对内则有一个难以“自圆其身”的所谓“末端复制问题”。端粒的存在正是扮演了一个卫士的角色，它就象是一个尽忠职守的“生命卫士”，不但避免了外界因素的入侵，而且在复制过程中，把基因组序列包裹在内部，以牺牲自身而避免染色体结构基因被侵蚀，从而防止了遗传信息的丢失，维护了染色体结构和功能的完整性。4端粒的功能当前第14页\共有75页\编于星期三\19点

对外:抵御核酸酶等外界对内:染色体脱氧核糖核酸的因素的袭击末端复制问题保护染色体结构和功能的完整性染色体当前第15页\共有75页\编于星期三\19点染色体脱氧核糖核酸的末端复制问题：3’5’5’3’RNA引物3’3’RNA引物水解即DNA复制过程不能"自始至终"完整地复制整个线性染色体，而是每次都在其5'末端留下一个空缺未能填补（即RNA引物降解），如果细胞没有办法添补这些空隙，染色体DNA将随着每一次的细胞分裂而不断缩短，直至这种缺隙侵蚀到染色体的结构基因而使细胞消亡。当前第16页\共有75页\编于星期三\19点领头链随从链5’5’当前第17页\共有75页\编于星期三\19点1)纤毛原虫动物四膜虫：其巨核形成过程中，经历了端粒从无到有的发育过程。2)酵母外源脱氧核糖核酸转化酵母细胞后，在其末端形成新端粒的效率很高。5端粒的研究体系当前第18页\共有75页\编于星期三\19点1）早期的原始复制模型2）端粒酶模型3）重组模型6端粒的复制模型当前第19页\共有75页\编于星期三\19点端粒酶的结构与功能当前第20页\共有75页\编于星期三\19点酵母细胞

酵母细胞酵母TS四膜虫TSShampay的加尾实验1端粒酶的发现当前第21页\共有75页\编于星期三\19点Blackburn的实验加热或蛋白酶孵育四GT酵GTpBR322四CA孵育四膜虫抽提物5’3’当前第22页\共有75页\编于星期三\19点1）端粒的加尾方向是按GT链从5’端3’端。2）每次加一个重复单位。3）似为“无模板复制”。4）被加尾的末端序列具有特异性。5）催化加尾的应是细胞抽提物中一种具有酶活性的物质。实验推论当前第23页\共有75页\编于星期三\19点2端粒酶的结构1987年，Blackburn柱层析RNP结构四膜虫端粒酶RNP含有RNA组分和蛋白质组分，两者均为酶活性所必需。对RNA酶极为敏感。RNA组分Protein当前第24页\共有75页\编于星期三\19点Telomeraseapocalypse-soon/images/telomere.gif当前第25页\共有75页\编于星期三\19点当前第26页\共有75页\编于星期三\19点CAACCCCAACAACCCCAA端粒酶RNA1）CAACCCCAA结构，有碱基修饰。2）反义RNA封闭，能抑制酶活性。反义RNA当前第27页\共有75页\编于星期三\19点3）Greider的点突变实验：点突变端粒酶RNA序列CA当前第28页\共有75页\编于星期三\19点端粒端粒酶CTTGCGCAT当前第29页\共有75页\编于星期三\19点CAA当前第30页\共有75页\编于星期三\19点端粒酶蛋白质1995年，首次从四膜虫克隆到端粒酶蛋白质组分：p80p95当前第31页\共有75页\编于星期三\19点遗传密码碱基互补当前第32页\共有75页\编于星期三\19点人类端粒酶蛋白质？同源序列核酸探针重组DNA分子当前第33页\共有75页\编于星期三\19点TTGGGGTTGGGGTTGGGG5’5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGCCAACCCC3’5‘oH3’5’CCAACCCC3’5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGCCAACCCC2.聚合

1.结合礼$3.移位

爬行模式3端粒酶的功能TTGGGGTTGGGGCCAACCCC当前第34页\共有75页\编于星期三\19点末端补齐机制：5‘GGGGTT（GGGGTT）n端粒酶5’G-G配对回折3‘5’DNA聚合酶当前第35页\共有75页\编于星期三\19点4端粒酶活性的测定当前第36页\共有75页\编于星期三\19点1994年，Kim首创端粒重复扩增法（TRAP）。当前第37页\共有75页\编于星期三\19点陷阱的电泳检测梯形条带加样孔当前第38页\共有75页\编于星期三\19点TS引物CX引物细胞提取物端粒重复序列PCR扩增产物当前第39页\共有75页\编于星期三\19点

T4g32,RnasinTRAPbufferdNTPs细胞提取物TS引物TaqECX引物23～25℃30minPCR仪当前第40页\共有75页\编于星期三\19点当前第41页\共有75页\编于星期三\19点生物素亲和素地高辛酶标抗地高辛抗体酶标仪检测半定量当前第42页\共有75页\编于星期三\19点当前第43页\共有75页\编于星期三\19点。当前第44页\共有75页\编于星期三\19点当前第45页\共有75页\编于星期三\19点当前第46页\共有75页\编于星期三\19点端粒、端粒酶与细胞衰老当前第47页\共有75页\编于星期三\19点

Inhumanbloodcells,thelengthoftelomeresrangesfrom8,000basepairsatbirthto3,000basepairsaspeopleageandaslowas1,500inelderlypeople.(Anentirechromosomehasabout150millionbasepairs.)Eachtimeacelldivides,anaveragepersonloses30to200basepairsfromtheendsofthatcell'stelomeres.当前第48页\共有75页\编于星期三\19点当前第49页\共有75页\编于星期三\19点Inmostsomatictissues,telomeraseisexpressedatverylowlevelsornotatall--ascellsdivide,telomeresshorten.Shorttelomeresmaybeasignalforcellstosenesce(stopdividing).TelomeraseandSenescence当前第50页\共有75页\编于星期三\19点染色体端粒端粒端粒与细胞存亡密切相关当前第51页\共有75页\编于星期三\19点细胞分裂细胞分裂端粒长短与细胞生命历程密切相关染色体端粒端粒细胞将停止分裂而趋于老化当前第52页\共有75页\编于星期三\19点细胞分裂细胞分裂染色体端粒端粒细胞将停止分裂而趋于老化当前第53页\共有75页\编于星期三\19点1）培养细胞：

端粒长度随分裂次数增多而缩短。端粒长度和细胞分化程度呈反比。2）人体：

端粒平均长度随年龄增大而变短。体细胞端粒长度大大短于生殖细胞。相关实验证据当前第54页\共有75页\编于星期三\19点端粒酶与细胞存亡端粒酶端粒端粒酶催化端粒不断延长，从而抵消因染色体复制、细胞分裂导致的脱氧核糖核酸缩短，使得染色体脱氧核糖核酸完好无损，细胞能够顺利地分裂繁殖。当前第55页\共有75页\编于星期三\19点相关实验证据：1）四膜虫：

端粒酶改变时端粒缩短、细胞死亡。2）酵母：

端粒酶基因突变导致端粒变短、细胞衰老。当前第56页\共有75页\编于星期三\19点端粒酶基因突变导致端粒变短、细胞衰老培养细胞中端粒长度随分裂次数增多而缩短端粒长度与细胞的年龄呈负相关端粒长度和细胞分化程度呈反比Estl突变体酵母活性下降，出现明显衰老四膜虫端粒酶改变时端粒缩短、细胞死亡体细胞端粒长度大大短于生殖细胞端粒平均长度随生物体年龄增大而变短。当前第57页\共有75页\编于星期三\19点

正常人体细胞缺乏端粒酶活性。与其他有端粒酶活性的生物体细胞相比,人体细胞具有很长的端粒。人的胚胎细胞具有明显可探测的端粒酶活性。人的端粒与端粒酶当前第58页\共有75页\编于星期三\19点端粒染色体脱氧核糖核酸端粒端粒酶端粒酶胚胎期当前第59页\共有75页\编于星期三\19点“人体细胞中端粒酶合成和延长端粒的作用是在胚系细胞中完成的，当胚胎发育完成以后，端粒酶活性就被抑制。即在胚胎发育时期获得的端粒，应已足够维系人体的整个生命过程中因细胞分裂所致的端粒缩短。所以，当人体出生以后，染色体端粒就象是一个伴随着细胞分裂繁殖的“生命之钟”，它历数着细胞可分裂的次数同时也见证了细胞由旺盛地生长繁殖到走向衰老死亡的整个生命历程。”当前第60页\共有75页\编于星期三\19点

正常细胞：细胞分裂细胞分裂

衰老死亡

细胞年轻化

端粒酶重新引入抗衰老当前第61页\共有75页\编于星期三\19点端粒、端粒酶与恶性肿瘤当前第62页\共有75页\编于星期三\19点1996年，著名的端粒（酶）研究专家Blackburn和Greider在总结端粒（酶）研究历程中曾说过一句颇为耐人寻味的话：在自然界中，你永远也无法想象，海底中的一块岩石也许是一片生命的绿叶，公园里的一朵鲜花可能就是一株剧毒的恶虫。当前第63页\共有75页\编于星期三\19点当前第64页\共有75页\编于星期三\19点细胞分裂细胞分裂细胞衰老端粒酶永生化抗肿瘤靶点当前第65页\共有75页\编于星期三\19点TelomeraseandCancerThepresenceoftelomeraseincancercellsallowsthemtomaintaintelomerelengthwhiletheyproliferate当前第66页\共有75页\编于星期三\19点

1端粒酶活性特异表达于恶性细胞（-）（-）